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目的:利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A的基因(lactate dehydrogenase A,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆、表达和免疫学特性的初步研究。
方法:利用生物信息学网站如NCBI和ExPASy中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶A(TsLDH-A)的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白的结构与功能;并将Ts LDH-A克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定及用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化产物用蛋白印迹(western Blotting)进行免疫学分析。
结果:该基因全长1332 bp,编码331个氨基酸。其氨基酸序列与其它物种LDH-A氨基酸序列一致性可达54%,具有乳酸脱氢酶保守结构域。其编码的蛋白理论分子量和等电点分别为35461.1 Da和7.09;有3个跨膜区,无亚细胞定位序列;具有多个磷酸化位点,蛋白的理化性质较稳定。预测有四个主要的B细胞抗原表住,L-乳酸脱氢酶活化位点之一的His192包含于表住190-199 aa中。酶催化位点的三个关键氨基酸在不同物种中保守,在空间结构上位置相互靠近。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-Ts LDH—A构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达。经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白能被Ts LDH-A重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染了猪带绦虫的病人血清及猪血清识别,表明其具有较好的免疫原性和免疫反应性。
结论:应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了Ts LDH—A的全长序列并预测得到其编码蛋白的结构与功能方面的信息,该基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。