杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征和敲除突变体获得

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杧果产业已成为中国热区农业支柱性产业之一。由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.&Sacc.)引起的杧果炭疽病是影响该产业健康发展的主要因素之一。该菌主要靠芽管顶端产生的黑色素化的附着胞直接穿透寄主表皮侵入为害,DHN黑色素是四大类黑色素之一,其合成途径的最后一步需要被漆酶氧化才能形成。漆酶是一类含铜的多酚氧化酶,与真菌的生长发育、分生孢子形成、黑色素合成、致病性等相关,常以多基因家族形式存在,漆酶蛋白序列并不具有较强的保守性,但都含铜离子结合保守结构域,即便来源同一病原菌漆酶家族中的不同漆酶基因,功能差异也较大。本课题组通过在橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组参考数据库搜索发现了12个漆酶基因。在杧果炭疽病菌中同源克隆后,研究表明漆酶基因LAC1主要调控菌丝的生长、发育、分化、黑色素的沉着,分生孢子、漆酶和纤维素酶的产生,对环境的适应性和对寄主的致病力;漆酶基因LAC2在接种后6 h表达量最低,9 h最高,可能在杧果炭疽病菌侵染寄主的过程中发挥着重要作用。本文同源克隆获得了漆酶基因Cglac3,DNA全长1 842bp,含有3个内含子,开放读码框大小为1 677 bp,编码558个氨基酸,分子量61.38 ku,等电点4.50,是一种碱性蛋白质,富含极性氨基酸,含铜离子结合保守结构域,不存在跨膜结构,存在1个信号肽,属于分泌型蛋白;二级结构中α-螺旋占12.72%,延伸链占27.78%,β-转角占7.53%,无规则卷曲占51.97%,与草莓炭疽病菌(C.goeosporioides)登录号为XP007273628.1的漆酶序列的相似性为98%;qRT-PCR分析显示在接种叶片后12h时表达量最高,24h时最低,72h内的平均相对表达量为9.80,可见与侵染过程密切相关;通过用绿色荧光蛋白-潮霉素B抗性基因(gfp::hygB)替换Cglac3编码区序列,成功获得了Cglac3基因的敲除载体pCglac3GH8;将其用PEG介导法转化的杧果炭疽病菌原生质体,经过含潮霉素平板筛选、PCR鉴定及实时荧光定量分析,初步确定获得了1个敲除突变体△Cglac3GH,为后续测定表型、确定Cglac3的功能打下了重要的材料基础。
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