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研究目的:本研究以不同浓度葡萄糖离体干预小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7细胞,检测不同浓度葡萄糖干预不同时长对巨噬细胞形态、增殖能力、炎症因子蛋白表达及分泌等的影响并进行机制研究,探索慢性高糖刺激对巨噬细胞极化的影响及其量效关系,一方面在糖尿病病因的基础研究方面有所创新,另一方面促进糖尿病病理机制探索及相关药物研发与筛选,进而推进糖尿病等慢性炎症性疾病的防治研究。研究方法:以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象进行离体实验,分别以正常生长液(含25mmol/L葡萄糖)和含40、60mmol/L葡萄糖的生长液培养细胞,干预1、3、5、7天后,1)应用相差显微镜观察巨噬细胞形态;2)应用CCK-8法检测巨噬细胞增殖能力;3)应用Westernblot法检测巨噬细胞IL-1β和IL-10蛋白表达水平;4)应用ELISA法检测巨噬细胞IL-1β和IL-10分泌量;5)应用Westernblot法和Real-TimePCR法检测巨噬细胞AKT、p S473-AKT蛋白和AKTmRNA表达水平。研究结果:60mmol/L葡萄糖处理:1)相差显微镜观察从形态学上显示高糖处理巨噬细胞1天即出现较多长梭形和多突形细胞,且周边和两极可见伸展的伪足,随干预时间延长,长梭形和不规则形细胞数量明显增加、体积明显变大,显示高糖干预下巨噬细胞产生典型的炎症相关形态学应答,且存在时间剂量依赖性。2)CCK-8法检测结果显示高糖处理巨噬细胞1天即明显抑制细胞增殖(P<0.01),随时间延长抑制效果有所改善,说明长期高糖干预明显抑制巨噬细胞增殖能力,尤其在高糖干预早期抑制效果更为明显。3)Westernblot检测结果表明高糖处理3天后,与同时间点的对照组相比,IL-1β蛋白表达增加、IL-10蛋白表达减少,至第5和7天与对照组相比出现显著差异(P<0.05),说明长期高糖干预导致巨噬细胞中炎症因子蛋白表达显著高于对照组,抗炎因子蛋白表达明显低于对照组,且存在时间和剂量依赖性,干预3天开始出现变化,至第5天出现显著变化。另外,从自身时间效应来看,对照组细胞中,与第1天和第3天相比,IL-1β表达在第5天出现明显下降,IL-10表达在第5天出现明显上升,而实验组细胞随时间延长变化趋势不明显,进一步说明长期高糖刺激导致巨噬细胞调节机体炎症水平功能受损的同时促进巨噬细胞向促炎性M1型转变,通过抑制抗炎因子表达增加和促炎因子表达降低,诱发持续慢性炎症反应。4)ELISA检测结果表明高糖处理1天后IL-1β分泌显著增加且随时间延长进一步增加(P<0.01),处理3天后IL-10分泌显著减少且随时间延长进一步减少(P<0.01),说明长期高糖干预促进巨噬细胞分泌促炎因子,抑制巨噬细胞分泌抗炎因子,这与结果 3)中细胞内蛋白表达结果基本一致,提示长期高糖对巨噬细胞分泌炎症因子的调控可能是通过调节细胞内蛋白表达实现。5)Westernblot检测结果表明高糖处理3天后AKT蛋白磷酸化被抑制,至第5和7天与对照组相比出现显著差异(P<0.05),说明长期高糖干预导致巨噬细胞促炎因子表达增加、抗炎因子表达减少的同时还引起AKT磷酸化激活明显降低,且随干预时间延长,其变化趋势与IL-1β表达基本相反、与IL-10表达基本一致,说明长期高糖刺激可能通过抑制AKT磷酸化激活诱发巨噬细胞向M1型转变。Real-TimePCR方法检测AKTmRNA水平未见明显差异(P>0.05),提示本研究中AKT蛋白激活水平的显著变化是由于转录后调控变化所致。以上研究中,40mmol/L葡萄糖干预也一定程度上引发炎症相关形态学应答,抑制细胞增殖,改变炎症因子蛋白表达和分泌,但作用不如60mmol/L葡萄糖显著和稳定。研究结论与建议:慢性高糖刺激诱导巨噬细胞向促炎性M1型转变,诱发巨噬细胞的持续慢性炎症反应,且存在时间和剂量依赖性,60mmol/L葡萄糖刺激作用更为稳定,其机制可能与抑制转录后AKT磷酸化激活有关。通过进一步研究慢性高糖刺激诱导巨噬细胞向M1型转变的具体机制及关键步骤,进而进行合理干预以扭转巨噬细胞极化分型的失衡,有望从新的角度探索糖尿病等多种慢性炎症性疾病的防治措施。