论文部分内容阅读
银耳(Tremella fuciformis)俗称白木耳,分类上属于真菌门,担子菌纲,银耳目,银耳科、银耳属,是著名的食药用真菌.银耳担孢子在一定的条件下以芽殖产生酵母状分生孢子,即银耳芽孢.近年来的研究结果显示银耳芽孢作为外源基因的生物反应器具有独特优势:(1)银耳芽孢单核,外源基因一旦整合成功,后代就能稳定遗传.我们对转gfp基因的银耳芽孢进行了十几代的继代繁殖后,在荧光显微镜下仍然能够检测到gfp基因表达的绿色荧光蛋白,说明外源gfp基因在银耳芽孢多代培养中是稳定遗传的;(2)银耳芽孢细胞转化操作简便、成功率高.我们采用电击法转化银耳芽孢完整细胞、醋酸锂介导转化银耳芽孢完整细胞、PEG介导转化银耳芽孢原生质体都已获得成功,转化效率高;(3)银耳芽孢表达的来源于真核生物基因的重组蛋白,其分子量、生物活性和功能与天然的蛋白质一致.我们把来源于软体动物福寿螺的多功能纤维素酶基因(mfc)在银耳芽孢中表达,其重组酶的分子大小与天然多功能纤维素酶的大小45.8Kda完全相符,而mfc在酵母表达系统中表达的重组酶大小接近66KDa.(4)银耳芽孢已有比较完善的高密度液体深层发酵培养技术.然而,近年来的研究结果也显示银耳芽孢作为生物反应器的不足:(1)外源基因的表达量偏低.我们采用来源于香菇、灵芝的gpd启动子驱动多功能纤维素酶基因(mfc)在银耳芽孢中表达,结果显示其滤纸酶和木聚糖酶的最高酶活性分别为37.06 U/mL和109.66U/mL,尚未达到产业化要求;(2)银耳芽孢表面存在一层咖喱状粘稠物质,严重影响银耳芽孢DNA的提取、目标产物分泌到培养基中以及目标产物的分离纯化;(3)缺乏安全选择标记.选择标记是载体转化银耳芽孢筛选转化子时必须的构件.目前在银耳芽孢转化上使用的选择标记为潮霉素抗性标记(潮霉素抗性基因hph),潮霉素的作用机理是通过阻断多肽的延伸干扰蛋白质的合成,从而抑制银耳芽孢的生长.然而潮霉素抗性基因的使用,不仅存在生物安全隐患,同时也影响了外源蛋白的合成.