论文部分内容阅读
目的:对8种甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)基因(MUT)的变异进行MCM蛋白表达量和酶活性的分析,验证这8种突变的致病性。方法:(1)选取8例甲基丙二酸血症患者的8种未报道的MUT基因错义突变(L140P、A141T、G161V、Q514K、I597R、G723D、W309G、I505T),利用生物信息学软件预测这些突变对MCM蛋白结构和功能的影响;(2)构建携带野生型及这8种突变型MUT cDNA的表达载体并转染293T细胞;(3)Western blot检测野生型及突变型MCM蛋白在293T细胞中的表达量;(4)UPLC检测293T细胞中野生型及突变型MCM酶活性。结果:(1)成功构建了含MUT cDNA的野生型和8种突变型(L140P、A141T、G161V、Q514K、I597R、G723D、W309G、I505T)表达载体;(2)Real time PCR提示8种错义突变型质粒未影响转染后293T细胞的MUT基因mRNA水平的表达;(3)western blot结果提示7种错义变异(G161V、W309G、Q514K、G723D、L140P、A141T及I505T)较野生型MCM蛋白表达量显著下降(P<0.05),而I597R与野生型相比较无差异(P>0.05);(4)UPLC结果提示8种错义突变型质粒转染后293T细胞的MCM蛋白酶活性(0.31±0.15、1.66±0.01、0.76±0.02、0.19±0.09、1.37±0.1 7、0.47±0.07、0.86±0.1 9和1.37±0.09 nmol/min/mg protein)均较野生型(3.1 1±0.09 nmol/min/mg protein)减低(P均<0.05);(5)结合患者临床表型分析,证实这8种MUT基因错义突变均为致病突变。结论:MUT基因的8种错义突变(G1 61V、W309G、Q514K、G723D、L140P、A141T及I505T)均未影响mRNA表达水平,而是通过降低MCM蛋白量的表达,导致酶活性降低,证实为致病突变。