【摘 要】
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[目的]本研究旨在探讨外排泵介导的鸭疫里氏杆菌耐药机制.[方法]利用同源重组原理,采用Premier 5.0软件设计目的基因的上下游同源序列引物,在上游引物加入Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,下游引物加入Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点,以鸭疫里氏杆菌基因组为模板,分别扩增外排泵基因acrB上下游同源序列并将测序正确的片段克隆到pBluescript SK(+)载体上.根据分离菌株对氯霉素敏感的特
【机 构】
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华南农业大学兽医学院,广东广州510642;广东省农业科学院农产品公共监测中心,广东广州510640
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨
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[目的]本研究旨在探讨外排泵介导的鸭疫里氏杆菌耐药机制.[方法]利用同源重组原理,采用Premier 5.0软件设计目的基因的上下游同源序列引物,在上游引物加入Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,下游引物加入Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点,以鸭疫里氏杆菌基因组为模板,分别扩增外排泵基因acrB上下游同源序列并将测序正确的片段克隆到pBluescript SK(+)载体上.根据分离菌株对氯霉素敏感的特点,利用PCR扩增、质粒抽提、限制性酶切、目的片段与载体连接等多种分子生物学技术,将pKD3质粒上的氯霉素抗性基因CmR克隆到目的基因上下游同源序列之间的位置,然后将片段共同连接到自杀性质粒pRE112,转化至大肠杆菌x7213感受态细胞,构建重组自杀性质粒pREΔacrB-Cm.利用氯霉素抗性筛选重组质粒,并设计相应引物扩增和测序、运用限制性内切酶酶切等技术鉴定重组质粒.[结果]结果表明,构建的含有氯霉素抗性基因的缺失突变载体经内切酶酶切及测序鉴定显示,产生的目的条带和序列与预期结果一致,表明已成功地构建了含有鸭疫里氏杆菌外排泵基因acrB片段的自杀性质粒.[结论]本研究构建的含有目的基因同源序列片段的自杀性质粒为后续构建基因acrB突变株及深入探讨外排泵介导的鸭疫里氏杆菌耐药机制奠定基础.
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