MoRab5酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

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Rab蛋白是小分子GTP结合蛋白,它在生物体中是高度保守的,并与上游调控子和下游特定的效应子相互作用,与GTP的结合和水解过程相偶联,从而在囊泡运输的不同阶段发挥作用。稻瘟病菌中编码Rab5蛋白的基因MgRab5(MGG01185.6)敲除后,其敲除突变体生长变得缓慢,产孢量显著下降,而且分生孢子萌发延迟,且不产生附着胞,说明该基因在调控稻瘟病菌侵染致病过程中起着重要的作用。为了弄清它的作用机制,从稻瘟病菌基因组中扩增MgRab5基因,并利用重叠PCR进行定点突变(Q79L),将其克隆到酵母双杂交的诱饵载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-Rab5,将pGBKT7-Rab5转入酵母菌株Y1 87中,挑取单菌落于SD-Trp培养基中培养,提取酵母质粒检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基及在X-α-gal上培养进行自激活检测。重组质粒测序结果与Rab5基因进行比较,定点突变成功,阅读框中其余序列完全匹配。载体pGBKT7-Rab5可以在酵母菌株Y187中正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-Rab5质粒对酵母没有毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从稻瘟病菌cDNA文库筛选诱饵蛋白Rab5下游的效应因子奠定了良好的基础,为进一步弄清Rab5在稻瘟病菌侵染致病过程中的作用机制提供了一个很好的平台。
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