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纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌中的一种高效和高安全的溶栓酶。本研究从纳豆芽孢杆菌的核DNA中克隆出纳豆激酶的全长基因pro-pre-nk和成熟肽基因NK,研究其在原核生物中的表达,以及酶的复性等,为基因工程生产高活力的纳豆激酶奠定基础。主要结果如下:(1).纳豆激酶基因克隆以及序列分析。从纳豆芽孢杆菌中提取DNA,根据GeneBank中注册的纳豆激酶基因序列设计引物,PCR扩增出纳豆激酶的全长和成熟肽基因,并克隆到pMD-19T载体。测序结果表明,克隆的纳豆激酶基因全长为1 143bp,共编码381个氨基酸,其成熟肽基因为825bp,编码275个氨基酸,与GeneBank中报道的序列(EF533986)同源性达到99%以上。(2).表达载体的构建。将纳豆激酶全长基因成熟肽基因克隆到表达载体pET-32a和质粒pQE-30,经过PCR反应和酶切检测,成功构建了表达载体pET-32a-pro-pre-nk,pET-32a-nk和pQE-30-pro-pre-nk,pQE-30-nk,获得转化的E.coli菌株。通过表达分析,选择pQE-30系列进行重组蛋白的表达和复性研究。(3).纳豆激酶表达及活性测定。测定了pQE-30-pro-pre-nk和pQE-30-nk转化菌株在不同浓度IPTG(0.1mol/L,0.3mol/L,0.6mol/L)、不同温度(28℃和37℃)和不同时间(1h-6h,24h,32h,48h,)时融合蛋白质的表达,并通过纤维板溶栓法测定表达蛋白活性。结果表明pQE-30-nk的胞内表达量很高,但主要为无活性的包涵体形式;pQE-30-pro-pre-nk在胞内无表达或表达量很低,但在其培养基分泌蛋白中检测到溶栓活性。(4).纳豆激酶的分泌表达。通过延长重组菌pQE-30-pro-pre-nk的培养时间至48h,收集培养基并分别通过45%和90%的硫胺沉淀收集蛋白,PBS溶解后测定的酶活性仍然很低,SDS-PAGE检测不到明显的目标带。(5).包涵体蛋白的复性。将pQE-30-nk菌株表达的包涵体蛋白用50 mmol Tris-HClpH=7.5,5mmol DTT,2%Triton-X-100,5mmol NaCl洗两次后,用尿素复性;或用IBIB和50mmol Tris-HCl pH=8.0将包涵体洗两次后,用尿素复性。两种方法所复性的蛋白均有不同程度的活性。而用8mol/L-0mol/L尿素梯度复性后的包涵体蛋白没有检测到活性。提高纳豆激酶基因的分泌表达和包涵体蛋白的复性效率等研究正在进行中。