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本研究选用近年来发展最快和最具潜能的真核表达系统-毕赤酵母,构建了重组表达载体pPIC9K-TSO18,并用G418抗性梯度筛选法,获得多拷贝重组菌株.对重组菌株利用甲醇进行诱导分泌表达,SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,诱导表达的培养上清中表达出大小为12ku和16ku具有反应活性的重组蛋白.用糖苷内切酶H(Endo-H)对TSO18蛋白分析后表明,目的蛋白进行了适度的糖基化修饰,与理论分析一致.通过对发酵条件如pH、温度和溶氧水平等的调整,重组毕赤酵母在5L发酵罐高细胞密度发酵中表达量高达2.54g/L,用薄层扫描分析,目的蛋白约占培养上清蛋白总量的80％以上.表达的重组蛋白TSO18用Sephadex G-100纯化.
为提高重组疫苗对本动物的免疫效果,本实验还构建了包含有IFN-γ和IL-4基因的真核表达质粒pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4,作为免疫增强剂.为证实重组抗原对本动物的免疫保护效果,将重组抗原与206佐剂结合,制成猪囊虫基因工程疫苗,对猪作了两批免疫试验.试验一在206作为佐剂的基础上,分别加上细胞因子(IL-4和γ-IFN)和CpG DNA作为免疫增强剂,免疫仔猪并攻虫感染.结果显示,实验各组在免疫后均产生了很高的抗体水平,从免疫保护效果来看,用pcDNA3.1/IFN-γ重组质粒作为猪囊虫重组抗原免疫增强剂,抗体检测结果没有明显升高,但是却明显增强了疫苗的保护效果,该组免疫猪减虫率最高达91％.而用pcDNA3.1/IL-4和pUC18/CpG作为免疫增强剂,虽然明显增强了疫苗的抗体水平,但对免疫保护作用没有明显的增强作用,两组减虫率分别为68.7％和67％,这可能与其诱发的免疫机制有关;在实验二中,对免疫剂量和攻虫时间进行了适当的调整,结果从实验猪剖检出的囊虫数分析,免疫组与非免疫组间有显著差异,以非免疫组作对照,免疫猪减虫率由70％上升到94％.
结果说明,用毕赤酵母高效表达了猪带绦虫六钩蚴TSO18重组抗原,且减虫率最高达到94％,说明本疫苗具有广阔的应用前景,有望成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂.