【摘 要】
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目的 体外拼装合成抗菌肽LL-37并构建重组表达载体spn8148-L,最终在乳酸乳球菌nz9000中分泌表达.方法 为了使人源抗菌肽LL-37在乳酸菌表达载体中获得高效表达,在不改变LL
【机 构】
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510515 广州,南方医科大学南方医院消化内科
【出 处】
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The 14th Congress of Gastroenterology China(第十四届全国消化系病学术会议)
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目的 体外拼装合成抗菌肽LL-37并构建重组表达载体spn8148-L,最终在乳酸乳球菌nz9000中分泌表达.方法 为了使人源抗菌肽LL-37在乳酸菌表达载体中获得高效表达,在不改变LL-37氨基酸的基础上,根据乳酸菌偏爱密码子表,重新设计LL-37的全长碱基序列,采用DNA work设计4条互补引物,并且在第1条和第4条引物上分别加入Knp Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点,利用S0E-PCR技术扩增完整的LL-37目的片段.将已扩增目的片段LL-37双酶切,与含有usp45分泌蛋白信号肽的spn8148分泌型乳酸乳球菌重组表达载体连接转化L.lactis受体菌nz9000,经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证,得到新构建的spn8148-L重组表达载体.在nisin诱导、Pnisa启动子的调控和usp45信号肽的正确引导下,相对分子质量约为4400的LL-37获得成功的分泌表达.L.lactis(spnz8148-L)诱导培养液上清液及其纯化产物通过Tricine SDS-PAGE均得到了目的大小的条带.结果 通过PCR技术得到约130 bp大小的LL-37目的片段,获得spn8148-L重组表达载体,其目的基因测序结果与设计序列完全一致,获得能分泌表达抗菌肽LL-37的新型乳酸乳球菌.结论 运用基因拼装和分子克隆技术成功拼装了LL-37全长基因和构建了重组表达载体spn8148-L,使乳酸乳球菌能够菌外分泌表达抗菌肽LL-37,使其含有与原始人源抗菌肽LL-37类似的抗菌效果,提高LL-37的获得效率,并为下一步测试抑菌效果和体外实验奠定基础.
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