论文部分内容阅读
目的 探讨二甲双胍对内皮祖细胞分化功能的影响及其可能机制方法 1.密度梯度离心法获取SD大鼠来源的骨髓单个核细胞,差速贴壁法结合EPCs专用培养基(EGM-2MV)定向诱导培养EPCs,在倒置显微镜下观察细胞形态学特征,应用免疫荧光技术对原代细胞进行鉴定,Dil与UEA 双染进行细胞鉴定.2.将2-5代的EPCs进行二甲双胍处理,进行细胞形态学观察、免疫荧光、流式细胞术检测表面抗原标志物变化.3.验证AMPK在二甲双胍促EPC分化的作用：将实验分为四组：A：正常对照组、B.10mM二甲双胍组、C.AMPK抑制剂Compond C (CC)组、D.10mM二甲双胍+CC组,培养24小时后收集四组细胞,提取蛋白,Western Blot检测AMPK、P-AMPK、P-mTOR、P70S6K的表达情况.4.验证eNOS-NO在分化中的作用：细胞分为四组：正常对照组、10mM二甲双胍组、一氧化氮合酶抑制剂L-NAME组、10mM二甲双胍组+一氧化氮合酶抑制剂L-NAME组,检测各组中p-eNOS表达变化,亚硝酸盐法检测培养液上清中NO含量.5.研究自噬在EPCs分化中的作用：正常对照组、10mM二甲双胍组、自噬激动剂Rapamycin组、Atg 5 siRNA干扰组、Atg 5 siRNA干扰后应用10mM二甲双胍组；检测Atg 5、LC3B、P62、Lamp等自噬指标的表达情况；5.检测EPCs分化后的功能变化：实验分为正常对照组、10mM二甲双胍组；对二组细胞进行成血管试验、细胞迁移试验,了解分化后的EPCs的成血管及迁移能力变化；实时荧光定量PCR及Western Blot检测MMP2、MMP9、uPA、AngⅡ、VEGF等表达情况.结果 1.密度梯度离心法结合差速贴壁法培养出的EPCs呈铺路石状,免疫荧光、双荧光染色及流式鉴定符合EPCs特点.2.二甲双胍处理过的EPCs细胞形态向成熟内皮细胞分化,流式细胞术检测提示CD133表达降低,VEGFR2及CD31、eNOS表达升高,vWF免疫荧光增强；3.二甲双胍处理组p-AMPK、p-eNOS表达增加,上清中NO含量增加,p-mTOR表达降低,自噬增强；抑制eNOS或自噬均可部分减少EPCs的分化作用.4.二甲双胍促进EPCs分化后,细胞的迁移能力降低,成血管能力增加,MMP2及MMP9表达减少,AngⅡ及VEGF无明显变化.结论 二甲双胍可促进AMPK-eNOS-NO及AMPK-mTOR-Autophagy两个通道来促进EPCs分化.分化后EPCs合成MMPs的能力及迁移能力下降.成血管能力增加,但AngⅡ及VEGF无明显变化.