猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用

来源 :河南省畜牧兽医学会第七届暨2008年学术研讨会理事会第二次会议 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ivan888111
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本文根据GenBank已登录的猪链球菌9型(SS9)cps9基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含cps9H部分基因的T载体重组质粒(pGEX-T-cps9H)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了SS9型的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR);对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,同时与常规PCR方法进行了对比实验。结果显示:标准曲线的曲线循环阂值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.996;所建立的FQ-PcR方法检测灵敏度可达1拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T-cps9H蕈组质粒和标准SS9株扩增曲线均呈现阳性反应,而对6个对照细菌和寄生虫DNA及SS2、SS7、SS1等三个标准链球菌株DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对小同浓度的pGEX-T-cps9H重组质粒分别重复扩增4次,重复性良好;用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染猪组织病料进行了应用检测,结果有3份样品为阳性,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。
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