荔枝霜疫霉RAPD-PCR的体系建立及遗传多样性分析

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荔枝霜疫霉病(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)是荔枝生产上的主要病害,在广东、福建、广西、四川和云南等荔枝主产区地都有发生,可引起花穗腐烂、落果和烂果,造成重大的经济损失。目前尚未见从分子水平揭示荔枝霜疫霉的遗传分化及群体遗传结构的研究报道。因此,本研究尝试应用RAPD标记技术,对我国荔枝霜疫霉的遗传多样性进行分析。采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取荔枝霜疫霉的基因组DNA。通过单因素的梯度试验,分析了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶的浓度及退火温度和循环次数对RAPD扩增的影响。然后再进行正交试验,优化了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶的配比浓度。结果表明,在进行荔枝霜疫霉RAPD扩增时,总体积为25μL反应体系中,模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶的最佳浓度分别为50 ng、1 mmol/L、0.25 mmol/L、0.2μmol/L和2 u。反应程序为94℃预变性2min,然后经94℃变性40s,36℃退火1min,72℃延伸1min,进行40次循环,最后在72℃再延伸10min。利用建立好的RAPD-PCR的体系,从210条RAPD随机引物中筛选出了16条条带清晰,多态性高,稳定性好的引物,并对采集自我国广东、广西、福建、四川及云南的100多株荔枝霜疫霉菌进行扩增。利用NTSYSpc Version2.1软件中的UPGMA方法分析菌株间的遗传相似系数,并进行聚类分析以构建树状类聚分析图。
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