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磷脂酶A2(PLA2s,EC 3.1.1.4),广泛存在于各种生物组织中,它可催化磷脂甘油分子二位酰基水解生成溶血卵磷脂和游离脂肪酸,在食品、化妆品及医药等领域有重要的实际应用价值。磷脂酶A2可以从一些哺乳动物的胰腺组织中提取,但是来源少,提取过程复杂且成本较高,不利于其推广和应用,而利用微生物发酵生产PLA2是实现其工业化应用的有效途径,Kluyveromyces lactis是食品安全级微生物,在外源蛋白的表达及应用方面具有很大优势。本研究首次成功实现了原核菌Lactobacillus casei DSM20011磷脂酶A2(pla2)基因在乳酸克鲁维酵母GG799中的分泌表达。对L.casei pla2基因编码的氨基酸序列进行信号肽预测,克隆出不含自身信号肽基因序列的pla2基因,构建表达载体p KLAC1-pla2,整合至K.lactis基因组LAC4位点,LAC4基因启动子控制pla2基因的表达,信号肽α-mating factor引导蛋白分泌。硼砂卵黄平板法在K.lactis/p KLAC1-pla2发酵上清液中检测到s PLA2酶活性,对发酵上清液进行SDS-PAGE分析,以K.lactis/p KLAC1为对照,可发现分子量大小为17 k Da的重组蛋白条带,与s PLA2理论分子量一致。通过荧光定量PCR确定了K.lactis/p KLAC1-pla2基因组中pla2基因的拷贝数,得到了pla2基因拷贝数为2至6的5株重组菌,研究了重组菌发酵上清液s PLA2酶活性大小与其pla2基因拷贝数的关系。结果表明,含有2个pla2基因拷贝的重组菌s PLA2酶活性最低,为0.27±0.06 U·m L-1,而含6个pla2基因拷贝的重组菌s PLA2酶活性最高,最高为1.87±0.12 U·m L-1,比最低者高约5倍;另外,含有3个pla2基因拷贝的重组菌s PLA2酶活为1.06±0.08 U·m L-1,高于含有4个或5个pla2基因拷贝的重组菌s PLA2酶活性。s PLA2催化反应过程中必须要有毫摩尔浓度Ca2+的参与,研究发现,不同浓度的Ca2+对s PLA化活性影响较大,s PLA2催化的最适Ca2+浓度为30 m M。LAC4基因启动子受乳糖或半乳糖诱导,研究诱导和非诱导条件下,LAC4基因启动子对pla2基因表达的影响。结果发现,K.lactis/p KLAC1-pla2在YPG培养基发酵培养84 h后,s PLA2酶活为1.96±0.15 U·m L-1;在YPD培养基发酵培养72 h后,s PLA2酶活为1.86±0.20 U·m L-1。在YPD培养基的基础上,研究了温度、p H和溶氧(装液量)对K.lactis/p KLAC1-pla2 pla2基因表达的影响。结果表明,温度30 oC、p H 7.0和装液量70 m L的条件有利于pla2基因的表达,s PLA2酶活达到2.16±0.18 U·m L-1。采用单因素试验和正交试验对培养基及培养条件进行优化,确定了重组菌产酶的摇瓶最佳发酵条件。结果表明,最优培养基组成为:葡萄糖30 g·L-1,酵母粉20 g·L-1,蛋白胨30 g·L-1,KH2PO4 3 g·L-1;最优培养条件为:温度30 oC,接种量2%(v/v),初始p H 7.0,装液量90 m L/250 m L三角瓶,摇床转速220 r·min-1,在此条件下发酵培养,酶活性由1.86±0.20 U·m L-1提高到5.35±0.27 U·m L-1。