【摘 要】
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Enterobacter cloacae WL1318是一株分离自塔里木河野生鲤鱼肠道的产氢细菌,能够高效发酵棉秆水解糖液产氢.为实现生物氢产量的进一步提高,本研究进行了该菌株中铁氢酶基因的克隆和原核表达载体的构建,以期进一步获得铁氢酶基因超表达的工程菌株.以E.cloacae WL1318基因组DNA为模板,利用简并引物首先克隆了约750bp大小的铁氢酶(hydA)基因全长序列,并进行测序验证,
【机 构】
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塔里木大学生命科学学院,塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室,新疆阿拉尔843300
【出 处】
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第二十次全国环境微生物学学术研讨会
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Enterobacter cloacae WL1318是一株分离自塔里木河野生鲤鱼肠道的产氢细菌,能够高效发酵棉秆水解糖液产氢.为实现生物氢产量的进一步提高,本研究进行了该菌株中铁氢酶基因的克隆和原核表达载体的构建,以期进一步获得铁氢酶基因超表达的工程菌株.以E.cloacae WL1318基因组DNA为模板,利用简并引物首先克隆了约750bp大小的铁氢酶(hydA)基因全长序列,并进行测序验证,序列分析表明,该序列上存在450bp左右的开放阅读框(ORF)与铁氢酶C末端保守序列(H-cluster)相似.因此,以hydA基因为模板,克隆了hydA ORF,将该目的基因连接到克隆质粒pUCm-T上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆并测序.测序正确的克隆质粒pUCm-T-hydA ORF和原核表达质粒pGEX-4T-3采用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切并纯化后连接,转化至DH5α中,经菌落PCR及双酶切验证,表明hydA ORF基因已成功插入pGEX-4T-3质粒中.该原核表达载体pGEX-4T-3-hydA ORF的成功构建为后续在E.cloacae WL1318中超量表达hydA ORF基因奠定了基础.
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