研究背景:机体通过模式识别受体(PRR)识别微生物的多糖、蛋白和核苷酸等成分,产生炎症因子和Ⅰ型干扰素(IFNα/β),发挥抗细菌或抗病毒的免疫防御功能。TBK1(TANK binding kinase 1)及其同源分子IKKε可以活化IRF3、IRF7调节IFNα/β的产生,在TLR、RIG-I以及dsDNA受体介导的抗感染天然免疫功能中发挥核心枢纽的作用。但是,TBK1活化的分子机制目前仍不清楚,尤其是蛋白激酶磷酸化修饰这一经典调控机制是否调节TBK1的激酶活性并调节Ⅰ型干扰素产生和抗病毒免疫反应还未有明确的结论。目的:探讨TBK1磷酸化修饰的关键位点并寻找磷酸化TBK1并活化TBK1的关键蛋白激酶。方法:首先采用蛋白质谱(MS)的方法分析TBK1在受到VSV病毒刺激后发生磷酸化修饰的潜在位点,然后借助于MS寻找能够与TBK1发生结合的蛋白激酶。采用点突变的方法突变MS发现的TBK1的磷酸化位点,结合IFNβ报告基因检测,验证TBK1发生功能性磷酸化修饰的位点;制备磷酸化位点特异性的单克隆抗体,验证VSV及HSV-1感染后TBK1发生磷酸化改变的位点。针对MS发现的蛋白激酶,使用siRNA的方法敲低其表达,通过q-PCR、ELISA和Western印迹的方法研究并寻找能够影响TBK1磷酸化并调节Ⅰ型干扰素产生的丝苏氨酸、酪氨酸蛋白激酶。借助于CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术删除相关蛋白激酶,验证其对TBK1磷酸化水平和激酶活性的影响。最后,使用体外激酶分析确认TBK1的上游蛋白激酶。结果:我们发现VSV刺激RAW264.7细胞后,TBK1在20余个丝/苏氨酸位点以及2个酪氨酸位点发生了磷酸化修饰。通过突变这些磷酸化位点结合报告基因分析,我们发现Ser93和Ryr179、Tyr185位点可能是TBK1的功能性磷酸化修饰位点。通过TBK1结合分子的MS分析,我们发现可能有20余种丝苏氨酸蛋白激酶和近10种酪氨酸蛋白激酶与TBK1的功能相关;通过siRNA敲低这些蛋白激酶,我们发现TAO3和c-Src可能是最为重要的促进TBK1磷酸化的上游蛋白激酶。TAO3敲低或者删除后,VSV和HSV-1诱导的TBK1的磷酸化(Ser72)显著下降,同时IFNα/β和水平显著降低,并且伴随TBK1激酶活性和IRF3磷酸化的降低;类似地敲低c-Src或删除c-Src的表达也可以显著抑制细胞抗病毒效应及TBK1的磷酸化和激酶活性。结论:磷酸化修饰是调节TBK1活性的重要调控机制,TAO3和c-Src可能是调节TBK1丝苏氨酸磷酸化以及酪氨酸磷酸化的关键激酶,这种经典的磷酸化调节模式可能在机体抗病毒过程中发挥关键的作用。