人参花蕾中人参皂苷的分离纯化与生物转化

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人参是传统名贵中药,始载于我国第一部本草专著《神农本草经》。人参皂苷作为人参中的主要成分,在心血管系统、肿瘤、中枢神经系统等疾病的治疗中有显著的疗效。人参花蕾是人参的生殖器官。近年研究表明,人参花蕾中含有二十种皂苷活性物质,其总皂苷含量比人参根高5倍以上。并含有十七种氨基酸、十几种多糖组分、多种微量元素、蛋白和挥发油组分。许多学者利用现代化的提取和分离技术,如:超声波辅助提取、微波辅助提取、C02超临界萃取、大孔吸附树脂法、高效液相制备色谱法和高效逆流色谱法,从西洋参、人参或者三七的根中分离出了人参皂苷、人参多糖等活性成分,而对于人参花蕾中的有效成分提取和分离的研究却很少。本文主要展开对人参花蕾中有效成分定性和定量的分析,创建了人参花蕾中的人参总皂苷和人参总多糖的联合提取工艺,采用正相低压制备色谱法分离人参花蕾中两类主要的人参皂苷-原人参二醇型和原人参三醇型皂苷,发现并通过实验证明了活性炭对不同种类人参皂苷有选择吸附性,将这种选择吸附性与制备型高效液相色谱技术相结合,从人参花蕾中分离出高纯度的人参皂苷Re,并对人参皂苷的生物转化进行了探索性的研究。通过泡沫实验和Salkowski反应对人参花蕾提取物的定性分析,检测出人参花蕾中含有大量的人参皂苷。建立了人参总皂苷和总多糖的定量分析方法。采用高效液相色谱法对人参花蕾中人参单体皂苷的含量进行了分析。该分析方法可以达到很好的分离效果,测定方法简便、快捷。结果表明,人参花蕾中主要含有原人参二醇型皂苷(人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd)和原人参三醇型皂苷(人参皂苷Re、Rg1)。建立了行之有效的人参花蕾总皂苷和人参花蕾总多糖的联合提取工艺。此工艺利用了人参多糖类组分溶于水但不溶于浓度较高的醇溶液的原理,从人参花蕾中获得人参总皂苷和总多糖,从而实现了资源的良好应用。采用了超声辅助提取法,大大缩短了实验时间的同时,提高了有效成分的提取率。并通过对超声辅助提取时间、次数、正丁醇萃取次数和沉降多糖时乙醇的加入量等影响因素进行优化,最终建立了一个稳定,快速的实验工艺流程,此工艺获得人参花蕾总皂苷粗粉中人参皂苷含量高于90%,人参花蕾总多糖粗粉中多糖组分含量为92%。利用正相低压制备色谱技术,将人参花蕾中两种主要的人参皂苷(原人参二醇和原人参三醇)分离。首先通过薄层层析技术,筛选出适合本实验的流动相:正丁醇-乙酸乙酯-水。通过选取合适的分离介质,流动相配比,流速和进样量,得到了最优的条件为:选取200-300目的硅胶,流动相为正丁醇:乙酸乙酯:水(4:1:5,v:v/:v)的体系,最优的流速和进样量分别为8 mL/min和400 mg。此分离条件下,原人参三醇类皂苷的纯度及收率为81.9%和81.3%。利用活性炭对人参皂苷具有选择吸附性的原理对人参花蕾总皂苷粗提液进行预纯化,与传统的方法相比较,本方法具有操作简单,分离效率高,有机溶剂消耗率低的特点。采用制备型高效液相色谱纯化人参皂苷Re。在反相制备型高效液相色谱上优化参数,确定了最适合制备色谱纯化G-Re的流动相为乙腈:水(23:77,v:v)。在流速为6 mL/min,上样量为10 mg时,人参皂苷Re的纯度最高可达98.5%,人参皂苷Re的纯度随着流速和上样量的增加而下降。对人参花蕾总皂苷的生物转化进行了探索性的研究。分析了产紫青霉(Penicillium purpurogenum)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的作用机制和人参皂苷生物转化的原理,通过产紫青霉β-D-葡萄糖醛酸苷酶对人参皂苷中葡萄糖苷键的水解作用,将人参花蕾中人参二醇类人参皂苷Rd水解成为人参皂苷Rg3。在温度为45℃,pH值=5.0,酶浓度为2mg/mL的条件下,反应时间对β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化人参皂苷有着很大的影响。反应12 h时,产紫青霉β-D-葡萄糖醛酸苷酶对人参花蕾总皂苷的转化率为4.95%。
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