研究背景:复发性口腔溃疡又称复发性阿弗他溃疡(Recurrent aphthou s ulcer,RAU),以溃疡疼痛、周期性、自限性、复发性为临床特点,发病率极高,治疗药物种类繁多,但临床无法根治,是口腔黏膜难治性疾病之一,其发生发展与免疫系统紊乱有着密切联系。Tregs和TH17为具有相同分化路径确具备不同功能的两种免疫细胞,其分化比例不平衡是诱导自身免疫系统紊乱的重要因素,激活TGF-β1和高表达TEAD1可以介导HI PPO信号途径促使Naive CD4+T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞分化。王汉明教授课题组前期发现,愈口宁汤剂可以促进复发性口腔溃疡(心脾积热证)患者溃疡愈合、增加血液中CD4+T淋巴细胞及TGF-β1的含量。因此,我们猜测,愈口宁可能通过调控TGF-β1/TEAD1/FOXP3信号通路促进CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞分化,进一步调控复发性口腔溃疡患者免疫状态,促进溃疡愈合。本文以复发性口腔溃疡(心脾积热证)SD大鼠为模型,挖掘愈口宁治疗复发性阿弗他溃疡的深层机制,明确该方部分作用靶点,为其推广应用提供理论依据。研究目的:探讨愈口宁介导TGF-β1/TEAD1/FOXP3调控心脾积热型复发性阿弗他溃疡Tregs分化机制研究方法:1.随机选取2019年1月至2019年12月于湖北省妇幼保健院口腔科就诊,临床诊断为复发性口腔溃疡(心脾积热证)的30例患者,签署知情同意书后纳入实验。观察治疗前后患者溃疡数目、溃疡面积、溃疡疼痛、烧灼感、充血程度、溃疡持续时间、口干口渴及二便改善程度。2.运用免疫法诱导溃疡产生,使用模具激怒及高脂辛辣饮食造出心脾积热证型大鼠共40只,造模成功后留取图片。将40只大鼠随机分为4组,分别给予生理盐水、左旋咪唑,清热解毒拆方及愈口宁灌胃,持续1周。1周后处死大鼠,留取溃疡黏膜行HE染色,留取腹主动脉血标本使用流式细胞学技术检测大鼠血液内CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞含量。3.SD大鼠RAU(心脾积热证)造模成功后,随机分为4组,连续1周分别灌服生理盐水、左旋咪唑,清热解毒拆方及愈口宁。1周后处死大鼠,剥离溃疡组织,提取组织蛋白,检测TGF-β1、TEAD1、TAZ表达量。研究结果:1.经过4周的治疗,复发性口腔溃疡患者溃疡面积减小有效率是87%、溃疡疼痛减轻有效率是90%、充血程度缓解有效率是97%、烧灼感减轻有效率是93%、溃疡数目减少有效率是87%、溃疡持续时间缩短有效率是100%、口干口渴症状缓解有效率是93%,大便改善有效率是100%、小便改善有效率是100%。2.(1)经免疫诱导法造模后,SD大鼠口内右下颊侧出现溃疡面。溃疡基底凹陷,溃疡面不规则,表面覆盖灰白色假膜,周围黏膜组织稍充血,大鼠口内唾液量丰富。(2)经生理盐水处理1周后,HE组织切片显示上皮缺损、不连续,固有层大量炎性细胞浸润;左旋咪唑组示上皮连续,固有层少量炎性细胞浸润;较生理盐水组相比,拆方清热解毒组及愈口宁组上皮完整连续,固有层无明显炎症细胞浸润。(3)左旋咪唑组与生理盐水组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞含量无明显差异(P>0.05);清热解毒拆方组与愈口宁组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞含量较生理盐水组增加,其中,愈口宁组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞含量较生理盐水组明显升高(P<0.05),但清热解毒拆方组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞含量与生理盐水组无明显统计学差异(P>0.05)。3.与生理盐水组比较,左旋咪唑组、拆方清热解毒组及愈口宁组TGF-β1含量明显上升;左旋咪唑组TEAD1含量下降,拆方清热解毒组及愈口宁组TEAD1上升;左旋咪唑组、拆方清热解毒组及愈口宁组TAZ含量下降,其中,拆方清热解毒组及愈口宁组TAZ含量较左旋咪唑组低。研究结论:1.愈口宁作为临床验方,不仅缓解溃疡疼痛,促进溃疡愈合,且明显缓解患者便秘、尿赤等兼症,近期疗效显著,发挥中草药独特优势。2.(1)愈口宁、拆方清热解毒中药及左旋咪唑均可促进溃疡上皮增生,恢复上皮连续,减轻固有层炎症细胞浸润情况。(2)愈口宁能够明显促进RAU大鼠血液中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞含量。3.愈口宁及拆方清热解毒组可明显促进TGF-β1、TEAD1蛋白表达,抑制TAZ蛋白含量,提示愈口宁及其清热解毒拆方可能通过调控TGF-β1,激活HIPPO信号通路。愈口宁促使CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞生成可能是通过刺激HIPPO信号通路所致。