银杏(Ginkgo biloba L.)隶属银杏科(Ginkgoaceae)、银杏属(Ginkgo),广泛分布在世界各地。银杏叶是一种潜在的功能性食品资源,具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、保肝、抗菌、抗高血压和抗癌等多种促进健康的有益活性。其活性成分主要包括多酚类、黄酮糖苷、多糖、氨基酸、银杏酸、萜类及多种微量元素。多糖是广泛存在于动物、植物、微生物中的天然高分子化合物,具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂等生物活性,已成为食品科学、天然产物等领域的研究热点。而关于银杏叶多糖的研究却鲜见系统的报道。本论文针对银杏叶多糖的提取、分离纯化、理化性质、抗氧化活性、免疫调节活性、体外模拟消化和酵解特性展开了较为系统的研究,可为银杏多糖的利用提供一定的理论基础与科学依据。主要研究内容及结果如下:(1)GBPS提取条件的优化、分离纯化及初步表征本实验选取提取温度、提取时间、液料比及提取次数分别进行单因素实验,考察4个因素不同水平对GBPS提取率的影响,通过比较GBPS得率筛选出三个显著影响多糖得率的因素及中心点:提取温度(80℃)、提取时间(3 h)、液料比(20 mL/g)。采用Box-Behnken设计法进行3因素3水平的响应面优化试验,得到GBPS最佳提取条件为:提取温度86℃、提取时间3 h、液料比22 mL/g,此时GBPS的得率为9.08±0.74%。通过DEAE Sepharose Fast Flow分离纯化得到多糖纯化组分GBPS-2和GBPS-3,其得率分别 9.45%±1.67%和 32.87%±3.11%。GBPS-2 和 GBPS-3 总糖含量分别为 71.46±1.93,44.32±1.18%,糖醛酸含量分别为12.49±0.98,38.37±1.62%,多酚和蛋白含量均小于0.3%。用液相对GBPS-2和GBPS-3分子量和单糖组成进行检测,结果表明GBPS-2 和 GBPS-3 分子量分别为 672 和 723 kD,其中 GBPS-2 主要由 Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara 组成,其摩尔比为 0.08:0.12:0.16:0.06:0.11:1.00:0.32,而 GBPS-3主要由 Man、Rha、GlcA、GalA、Gal 和 Ara 组成,摩尔比为 0.92:1.00:0.83:0.11:0.42:0.23。(2)GBPS-2和GBPS-3的抗氧化活性本章通过化学抗氧化方法分别评价GBPS-2和GBPS-3的抗氧化活性。GBPS-2和GBPS-3均具有较强的清除ABTS和超氧阴离子自由基活性,抑制β-胡萝卜素亚油酸氧化及铁离子螯合的能力,而对DPPH和羟基自由基的清除能力较弱,同时总抗氧化能力和还原力均显著低于阳性对照。利用PC12细胞为模型研究GBPS-2和GBPS-3在细胞水平的抗氧化活性,结果表明GBPS-2和GBPS-3均可以显著抑制H2O2介导的细胞氧化损伤,对PC12有一定的保护作用,同时降低PC12细胞分泌的LDH和MDA水平,而增加细胞抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的水平。化学抗氧化和细胞抗氧化的实验结果均表明GBPS-3的抗氧化活性要优于GBPS-2。(3)GBPS-2和GBPS-3的体外免疫调节活性本章采用小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)为模型研究GBPS-2和GBPS-3的免疫调节活性,GBPS-2和GBPS-3在50-200 μg/mL的浓度下对RAW264.7细胞均没有显著毒性,其中GBPS-2在200 μg/mL的浓度时会显著促进RAW264.7细胞增殖。GBPS-2和GBPS-3均可以显著提高RAW264.7吞噬中性红的能力及酸性磷酸酶活性,并促进RAW264.7细胞NO、PGE2和细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌量。利用RT-qPCR检测NO、PGE2和细胞因子在mRNA水平表达量,结果表明GBPS-2和GBPS-3可以显著刺激 COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6 和 IL-1β在 mRNA 水平的表达。利用 Western Blot检测GBPS-2对COX-2和iNOS在蛋白水平表达,结果表明GBPS-2可以显著促进COX-2和iNOS在蛋白水平的表达。因此GBPS-2和GBPS-3对RAW264.7细胞具有较好的免疫促进作用。利用Western Blot检测GBPS-2对RAW264.7细胞中P65、IκBα和p-IκBα在蛋白水平的表达量的影响,结果显示GBPS-2显著增加p65和p-IκBα蛋白的表达量而降低IκBα蛋白的表达量,表明GBPS-2可能是通过NF-κB通路激活了细胞因子的转录和表达从而增强巨噬细胞的免疫活性。(4)GBPS的体外模拟消化与肠道微生物的厌氧发酵研究本章采用体外唾液、模拟胃液、小肠液消化模型,并检测消化过程中相对分子质量和还原糖含量,研究GBPS的体外模拟消化特性。唾液、胃液和小肠液消化前后GBPS的分子量没有显著变化表明唾液、胃液和小肠液对GBPS均没有消化作用;消化后还原糖含量也没有显著增加,表明唾液、胃液和小肠液消化后没有没有产生新的多糖还原末端,因此GBPS不会被口腔、胃和小肠消化系统消化顺利达到大肠。进一步利用体外肠道微生物的厌氧发酵模型研究GBPS与肠道微生物的相互作用,发酵后GBPS分子量的响应值逐渐降低,同时发酵液中多糖含量和还原糖含量均随着发酵时间增加而逐渐降低,表明不被消化系统消化吸收的GBPS在大肠中可以被肠道微生物逐渐的水解利用。同时GBPS可以显著降低发酵液的pH而促进肠道微生物分泌乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。同时GBPS可以促进肠道微生物总菌、拟杆菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属的增殖。综合来看GBPS具有一定的益生活性。(5)GBPS-2和GBPS-3对肠道微生物的调节活性本章利用体外肠道微生物的厌氧发酵模型和16S rRNA测序技术进一步研究GBPS-2和GBPS-3对肠道微生物的调节活性。GBPS-2样品中Chao、ACE和Shannon指数均显著高于GBPS-3,结果表明相比GBPS-3而言GBPS-2更有助于提高肠道微生物的种类和多样性。同时利用基于OTUs水平的主成分分析(PCA)、主坐标分析(PCoA),非度量多维尺度分析(NMDS)和聚类分析研究GBPS-2和GBPS-3对肠道微生物整体组成影响,PCoA、NMDS和聚类分析的结果均表明GBPS-3与BLK组菌群结构比较相近而GBPS-2与INL菌群组成比较相似,因此GBPS-3比GBPS-2具有更好的调节肠道菌群的活性。GBPS-3和GBPS-2可以显著促进乙酸、丙酸和丁酸的分泌,其中GBPS-2组乙酸和丁酸含量显著高于GBPS-3组,而GBPS-3组丙酸显著高于GBPS-2组。结果表明GBPS-2和GBPS-3均具有潜在的益生活性。