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埃博拉病毒病(EVD)是由丝状病毒科埃博拉病毒(EBOV)感染人类和非灵长类动物导致的致命性传染性出血性疾病,病死率高。尽管目前针对EVD的研究和治疗取得显著进步,但EBOV在宿主细胞内的生命周期相关分子机制等仍不明确,可用于EVD患者的有效治疗仍非常有限。本研究拟在2级生物安全实验室环境下,构建具备复制和转录基本功能的埃博拉病毒样颗粒(EBOV-trVLPs),合成靶向与RNA病毒生命周期(病毒入侵、脱壳、融合、复制、装配及出芽等)密切相关的宿主siRNAs,通过RNA干扰(RNAi)来筛选对EBOV-trVLPs复制产生重要影响的宿主蛋白,并验证宿主蛋白与EBOV-trVLPs GP、VP40蛋白及核酸的相互作用关系。通过杂交瘤技术合成抗EBOVGP和VP40单克隆抗体(mAb),开展体外抗EBOVGP和VP40 mAb单用及联合应用针对EBOV-trVLPs的抗病毒效应研究。在本研究中,我们发现宿主分子伴侣、膜转运蛋白和信号转导蛋白等与EBOV-trVLPs生命周期密切相关,并与trVLPs的GP、VP40蛋白及核酸发生相互作用;证实抗GP和抗VP40 mAb的联合、抗VP40 mAb之间的联合具备协同抗病毒效应。第一部分 埃博拉病毒样颗粒体外复制系统的建立目的:EBOV在宿主细胞内的生命周期仍有诸多不明确之处,但鉴于其生物安全级别定性为4级,极大地限制了研究人员对该种属病毒的研究。因此,本研究拟在2级生物安全实验室构建EBOV-trVLPs,模拟EBOV野毒株的生命周期及基本功能,以期进行后续研究。材料和方法:在2级生物安全实验室环境,应用反向遗传学原理,将携带有EBOV各段基因信息的质粒共转染293T细胞,构建具备复制和转录基本功能的病毒样颗粒(trVLPs),通过检测trVLPs所携带报告基因的吸光度值监测trVLPs的包装效率,电镜观察trVLPs形态,荧光显微镜观察DiI标记trVLPs入侵293T活细胞过程。结果:从P0-P5代trVLPs报告基因的吸光度值呈现逐渐递增趋势,证明该系统具备稳定复制能力。trVLPs在电镜下主要表现为丝状病毒样颗粒,从大小和形态学上高度模拟EBOV野毒株。DiI标记trVLPs具备侵入活细胞的能力并在细胞内进行运输。结论:在2级生物安全实验室环境中,构建能在体外细胞内稳定复制、并模拟EBOV野毒株的生活周期和基本功能的trVLPs;trVLPs没有生物危害性,具有稳定性和可监测性特点,是研究EBOV的良好载体和工具。第二部分 EBOV-trVLPs生命周期相关的重要宿主因子筛选及相互作用的研究目的:EBOV在宿主细胞内生命周期涉及众多宿主因子,并可能与之发生相互作用,但其中涉及的宿主因子、发生机制和相互作用关系等仍有诸多不明确之处。材料和方法:我们在EBOV-trVLPs构建的基础上,合成靶向与RNA病毒生命周期(病毒的入侵、脱壳、融合、复制、装配及出芽等)密切相关的宿主siRNAs,通过RNA干扰技术(RNAi)来筛选对EBOV-trVLPs复制产生重要影响的宿主蛋白,应用免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、蛋白免疫印迹等方法初步明确宿主蛋白与EBOV-trVLPs GP、VP40蛋白及核酸是否存在相互作用关系。结果:SiRNAs 敲减 ANXA5、ARFGAP1、FLT4、GRP78、HSPA1A、HSP90AB1、HSPA8、MAPK11、MEK2、NTRK1和YWHAZ等11个宿主蛋白后能有效抑制trVLPs复制(p<0.05),其中 FLT4、GRP78、HSPA1A、HSP90AB1、HSPA8、MAPK11、MEK2、NTRK1和YWHAZ等9个蛋白与GP存在相互作用;ANXA5、GRP78、HSPA1A和HSP90AB1等 4 个蛋白与 VP40 具有相互作用;HSP90AB1、ANXA5、ARFGAP1、FLT4、GRP78、HSPA1A、MEK2、NTRK1和MAPK11等9个蛋白与trVLPs核酸具有相互作用。结论:我们系统性评估了宿主分子伴侣、膜转运蛋白和信号转导蛋白与EBOV-trVLPs生命周期密切相关,并与trVLPs的GP、VP40蛋白及核酸发生相互作用。第三部分 抗埃博拉病毒GP和VP40单克隆抗体体外抗病毒效应的研究目的:单克隆抗体(mAb)是当前治疗EVD的有效方法之一。目前,抗EBOV抗体多限于抗GP蛋白抗体,抗体联合应用也仅限于抗GP抗体之间的联合,关于抗GP和抗VP40抗体之间联合应用尚未见报道。因此,我们拟在EBOV-trVLPs基础上,开展抗GP和抗VP40抗体联合抗病毒效应的研究。材料和方法:我们通过杂交瘤技术合成抗EBOVGP和VP40mAb,在构建EBOV-trVLPs复制系统的基础上,应用RT-PCR、蛋白免疫印迹及细胞原位荧光等方法开展体外抗EBOV GP和VP40 mAb对EBOV-trVLPs的抗病毒效应研究,并验证抗EBOVGP和VP40 mAb联合应用的抗病毒效应。结果:抗GP和抗VP40 mAb单独应用在5-10μg/ml剂量下能有效抑制trVLPs复制(P<0.05);抗GP和抗VP40mAb、抗VP40mAb之间的两两联合(抗体的鸡尾酒疗法)与抗体单独应用对比,在总剂量相等情况下,具有更显著的抗病毒作用(P<0.01),提示联合应用具有协同抗病毒效应。结论:本研究进行了体外抗EBOV GP和抗VP40mAb的抗病毒效应的研究,并证实抗GP和抗VP40mAb的联合、抗VP40 mAb之间的联合具备协同抗病毒效应,抗体靶向作用位点及协同作用机制有待于进一步研究。