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宫颈癌是全世界上女性发病率和死亡率中第二大最常见的癌症。人乳头瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌的一种主要病毒,其中高危型以HPV 16和HPV 18为主,高危型HPV编码2个重要的致癌基因E6和E7,其主要作用是启动细胞转化,多步参与病毒和细胞蛋白的相互作用,参与HPV感染、细胞转化、癌症的进程。抑癌基因p53在细胞周期进程中对G1和G2/M期校正点进行监测,与转录激活作用密切相关。在HPV阳性宫颈癌细胞中,p53在功能上被E6癌蛋白拮抗,E6蛋白能结合p53蛋白,并诱导其经泛素化介导的途径降解,E6促进泛素调控p53的退化来抑制凋亡。WEE1激酶是一种细胞周期调节蛋白,其mRNA的3’端和5’端各有两种长短不同的UTR,包括四种不同的异构体,3’较长的UTR(3N)、3’较短的UTR (3X)、5’较长的UTR(5L)和5’较短的UTR (5S); 5’端序列上有两个磷酸化位点,能被泛素化系统识别和降解,影响到该蛋白的半衰期；WEE1激酶对G2/M检查点和S期起着重要的调控作用,对p53突变或缺失的癌细胞能引发有丝分裂灾难。本研究选取了3种宫颈癌细胞,SiHa细胞中含有整合的1-2个拷贝的HPV 16,E6的表达水平较低,p53的表达水平较高；CaSki细胞中含有600个拷贝的HPV16,E6的表达水平比较高,p53的表达水平又较低；C33A细胞中无HPV,含有突变型的p53,其表达水平比较高。由于细胞内氧化分子会损伤DNA,因此利用双氧水(H2O2)处理这3种细胞会引起DNA损伤应答,观察氧化压力下DNA损伤后WEE1异构体的反应。用荧光定量PCR检测不同浓度梯度H202处理3个细胞的mRNA变化水平,结果发现WEE1的3X和5S都有变化；然后利用确定的半致死量和时间点处理细胞。由于宫颈癌各细胞系中E6和p53基因含量的不同,设想调整它们的表达水平是否影响WEE1异构体的变化；有文献报道p38MAPK信号通路在p53缺陷细胞中是主要修复调控信号途径,需要确定下调MK2阻断该途径是否影响了WEE1异构体的调控。本实验主要利用与HPV相关的E6基因和p53基因,研究其相互作用对WEE1异构体(isoforms)的影响,对宫颈癌的研究具有重要的意义。研究结果：1.荧光定量PCR检测H202处理3个宫颈癌细胞的mRNA变化,结果发现WE E1的3X和5S的变化较为明显;MTS法检测出SiHa细胞的半致死量为0.8mM,CaSki细胞的半致死量为0.8mM,C33A细胞的半致死量为0.5mM;时间点的检测结果中发现在2.5小时,MEE1 3X 和 5S的变化最大,其它的异构体3N、5S和T的值变化微弱,其中CaSki细胞中上升的比值最高,C33A细胞次之,SiHa细胞中升高的比值相对较低。2.上下调相应的各个基因来处理各个细胞系后的变化。在CaSki细胞中上调p53基因,WEE1 3X和5S都有升高；下调MK2基因,WEE1 5S下降明显。在SiHa细胞中上调E6和E6*基因,间接下调p53蛋白,WEE1 3X下降,5S变化较小；直接下调p53基因时,WEE1 3X下降,5S变化不明显。在C33A细胞中上调E6和E6*基因,WEE1 3X上升,5S变化微弱；下调p53,WEE1 3X5S变化微弱。结论：1.p53的含量主要影响了WEE1 3X水平的变化,p53被上调含量较高时,WEE1 3X都有升高；p53被直接下调含量较低时,WEE1 3X都有降低；说明在氧化压力下p53能影响WEE1 3’端较短的UTR,对其剪接变化起调控作用,影响细胞周期进程。2.上调E6和E6*,间接的下调p53时,含野生型p53的细胞,WEE13X同样会下降,但在含有突变型的细胞中,反而是上升的结果,这可能与p53的状态相关。3.在p53含量较低的CaSki细胞中,下调MK2基因阻断p38PMAPK信号途径时,EE1 5S下降明显,说明该通路在p53低水平时很可能是调控WEE1 5’端的信号途径。