研究背景：生长激素(Growth Hormone, GH)是体内促进生长发育代谢等的重要激素。早期GH的体内提取,产量有限,临床上只能用于儿童生长激素缺乏症(growth hormone deficiency, GHD)的治疗。随着生物工程合成人生长激素(Recombinant human growth hormone, RhGH)的技术进步,重组人生长激素的合成,使之迅速得到临床研究与治疗的广泛应用。从GHD扩展到特纳综合症(Turner’s syndrome, TS)、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)、失代偿性肝硬化、烧伤等方面。胰岛素(insulin)是体内另一种重要的激素,与细胞增殖,存活,代谢,衰老,肿瘤等密切相关。胰岛素也同样广泛地用于临床上糖尿病等病的治疗。然而,在GH的长期使用过程中出现高血糖、高胰岛素血症等胰岛素信号抑制等现象。而胰岛素依赖型糖尿病患者,可出现肝内GH信号受损。因而,体内两种重要的激素,存在着密切的关系。研究两者的相互作用及对彼此信号通路的影响,对临床应用的实践及疾病机制的理解,具有重要的意义。生长激素和细胞膜上的生长激素受体(growth hormone receptor, GHR)结合,因而激活胞质内的酪氨酸激酶(Janus kinase2,JAK2),后者发生自身磷酸化,进而磷酸化GHR,然后在JAK2和GHR共同作用下,活化信号转导与转录活化因子5(signal transducer and activator of transcription5, STAT5)。STAT5转移到细胞核内,与其调节基因转录启动子的特殊序列结合,激活下游基因的转录,进而调节细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等许多生物学过程。胰岛素与胰岛素受体(insulin receptor, IR)的结合导致胰岛素受体构型的变化,引起细胞膜内的酪氨酸位点发生自身磷酸化。其自身磷酸化可促进与胰岛素受体底物(insulin receptor substrate, IRS)的结合,进一步激发IRS磷酸化反应。磷酸化的IRS介导磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)等下游信号。活化的P13K催化磷脂酰肌醇4,5二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PI(4,5)P2)生成磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PI(3,4,5)P3),PI(3,4,5)P3,后者激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt),进而介导糖原合成酶激酶(Glycose synthase kinase, GSK),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR),细胞凋亡相关的BAD蛋白等下游信号分子,从而调控细胞的代谢、增殖、分化与凋亡等。有关GH对胰岛素信号影响的研究较多,但胰岛素对GH信号影响的研究报道很少。研究表明GH和胰岛素信号存在着共同的通路,两者可以通过共同的机制相互影响。肝脏是调节体内物质代谢的重要器官,接受众多激素和细胞因子等因素的调控,如GH和胰岛素。为了更好地研究两种激素问的关系,我们在同样的技术背景条件下同时研究两者相互作用的关系,本课题选取肝脏内的Insulin/PI3K/Akt信号通路及GH/JAK2/STAT5信号通路为研究对象。本文同时在动物水平(in vivo)及细胞培养水平(in vitro),研究肝脏生长激素与胰岛素间的相互作用及其可能的机制。抑癌基因第10号染色体同源性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten, PTEN)是胰岛素信号通路的主要负调控因子,和P13K的调节亚基p85结合,从而导致p85的脱磷酸化,进而介导下游一系列的信号。该分子的异常表达与许多疾病相联系,例如,胰岛素抵抗,肿瘤发生等。PTEN的突变,可以导致胰岛素信号的异常激活。最近的报道显示,GH的长期刺激可以导致PTEN的功能变化,进而与胰岛素信号的变化相关联。这说明了,胰岛素和GH间的相互作用关系,其相互作用的关键机制可能涉及到PTEN。因此,本课题采用干扰siRNA技术,扩增PTEN的野生或突变型质粒等技术,探究生长激素和胰岛素间相互关系的可能分子机制。[目的]同样的技术背景条件下,研究预处理GH对胰岛素信号p-Akt的影响,及预处理胰岛素对GH信号P-STAT5的影响。通过观察PTEN的功能变化对应下的信号关系,探究PTEN在两种激素相互作用中的作用。[方法]一、细胞实验部分1.本论文选择肝癌细胞系HepG2,在10%胎牛血清DMEM中培养。细胞信号实验前,饥饿12小时。细胞裂解液为RIPA缓冲液.Western blot蛋白分析法检测P-Akt、Akt、p-STAT5及STAT5等分子表达水平。研究内容1：研究生长激素对胰岛素信号的时间效应实验1：HepG2细胞分为3组：GH Control组、30min GH组和4h GH预处理组,各组设置2个样品,裂解前分别予以10分钟胰岛素刺激或磷酸缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)刺激。实验2：为了研究生长激素对胰岛素信号的时间效应机制,本课题扩增或剔除胰岛素信号中的一个关键负调控分子PTEN。上述实验1中的细胞分别转染质粒PTEN、siPTEN或PTEN无功能性突变基因C124S。实验设计仍然分为3组：GH Control组、30min GH组和4h GH预处理组,各组设置2个样品,裂解前分别予以10分钟胰岛素刺激或PBS刺激。研究内容2：研究胰岛素对生长激素信号的时间效应HepG2细胞分为4组：胰岛素Control组、10min胰岛素组、30min胰岛素组和4h胰岛素组,每组2个样品,裂解前分别刺激GH30min、GH4h或PBS。2、统计分析：分析软件为Excel2010及SPSS13.0。多组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA),多重比较采用Bonferroroni(方差齐)或Dunnett’sT(方差不齐)检验。以P<0.05视为有显著性差异。二、动物实验部分本课题使用6-8周龄Balb/c雄性小鼠。小鼠来源于南方医科大学动物中心,实验在南方医院动物中心进行。1、小鼠随机分为GH对照组(A组)和GH预处理组(B组)、胰岛素对照组(C组)和胰岛素预处理组(D组)。小鼠每天下午腹腔注射RhGH (1ug/g体重)(B组)或等量PBS溶液(A组),持续3周,该两组小鼠临处死前10分钟腹腔注射重组人胰岛素(2IU/Kg)。另两组的实验,小鼠在临处死前4h予以腹腔注射重组人胰岛素(D组),或等体积PBS溶液(C组),该两组小鼠在处死前30min均注射RhGH。收集每组小鼠的肝脏组织,液氮冰冻组织,转移至-80℃冰箱中保存。a.比较研究：GH预处理(B组)和PBS对照组(A组)两组各8只小鼠体重增长情况,肝脏内Akt及P-Akt表达水平。b.比较研究：GH预处理(B组)和PBS对照组(A组)两组肝脏PTEN表达水平及其它蛋白,如内参β-actin等。c.比较研究：胰岛素预处理组(D组)和生长激素对照组(C组)肝脏STAT5及P-STAT5表达水平。2、统计分析：分析软件为Excel2010及SPSS13.0。多组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA),多重比较采用Bonferroroni(方差齐)或Dunnett’sT(方差不齐)检验。以P<0.05视为有显著性差异。[结果]一、细胞实验结果1、与无GH刺激的HepG2细胞Akt磷酸化水平相比,30min GH预处理后可以使细胞内Akt磷酸化水平无显著变化(p>0.05),4h GH可以使细胞中Akt磷酸化水平显著下降(P<0.05)。2、与GH对照组相比,扩增wtPTEN基因表达后,30min GH使细胞内Akt磷酸化水平显著降低(P<0.05);4hGH可以使细胞中Akt磷酸化水平下降更显著(P<0.05)。3、与GH对照组相比,沉默PTEN基因表达后,30min GH使细胞内Akt磷酸化水平略上调(P>0.05)；而4h GH不能使细胞内Akt磷酸化水平降低,反而使其显著升高(P<0.05)。4、与GH对照组相比,扩增PTEN无功能性突变基因C124S表达后,30minGH同样使Akt磷酸化水平略上调(p>0.05)；而4h GH则使细胞Akt磷酸化水平显著升高(P<0.05)。沉默PTEN基因表达与扩增PTEN无功能性突变基因C124S表达后的实验结果相一致。5、与胰岛素对照组内的STAT5磷酸化的表达水平相比,10min胰岛素、30min胰岛素及4h胰岛素刺激对HepG2细胞水平内STAT5磷酸化的表达水平无显著影响(P>0.05)。二、动物实验结果1、经过三周的GH刺激后,GH预处理组小鼠的体重的增加幅度较对照组显著增加(P<0.05)。与GH对照组相比,GH组小鼠肝脏细胞内稳定的P-Akt表达水平显著降低(P<0.05)；其组内组小鼠PTEN表达水平则显著升高(P<0.05)。2、与胰岛素对照组小鼠的STAT5磷酸化水平相比,经胰岛素预处理的小鼠肝脏内STAT5磷酸化水平显著降低(P<0.05)。但这与细胞实验中得到的结果并不一致。[结论]1、在体内体外的情况下,GH刺激均可导致Insulin/PI3K/Akt信号通路的抑制。扩增抑癌基因wtPTEN,可增强GH对胰岛素信号通路的抑制,相反的,沉默PTEN基因或扩增PTEN无功能性突变基因C124S,则可降低GH对胰岛素信号通路的作用。在体内实验情况下,GH预处理的小鼠肝脏P-Akt表达水平显著降低,而PTEN的表达水平则显著升高,可见GH对健康小鼠肝内Insulin/PI3K/Akt信号的作用可能涉及到抑癌基因PTEN功能调节。2、而胰岛素对生长激素的作用的研究结果显示,HepG2细胞经过胰岛素预处理后,其STAT5磷酸化水平表达未受显著影响。而在健康小鼠体内,经胰岛素刺激的小鼠体内STAT5的磷酸化水平显著较胰岛素对照组水平低。胰岛素对生长激素的影响在体内外实验中的结果并不一致,可能因为体内存在着复杂的激素或生长因子相互作用的结果,提示体内信号间关系复杂性及调节多样性之间的稳态有关。