脂肪酶的催化反应需要酶分子快速地吸附在油水界面上。在吸附过程中,脂肪酶“盖子”的打开使得活性中心暴露,底物进入催化口袋。同时,在催化活性中心形成大量的疏水界面和界面识别位点,使得盖子更有利地和油水界面结合。因此,盖子结构中的特定氨基酸排布对脂肪酶的吸附过程、底物选择性和催化活力有着重要意义。脂肪酶T1来源于Geobacillus zalihae菌株,属于脂肪酶I.5家族,具有较高的热稳性,因而在工业界受到广泛。螺旋a6和a7被报道为脂肪酶T1的盖子结构,其中螺旋a6由疏水氨基酸和亲水氨基酸交替排布组成,而螺旋a7主要由疏水氨基酸组成。并且,螺旋a6在界面激活过程中发生了重新组合,并且移动20?的距离。本文为了研究螺旋a6特殊的氨基酸排布对界面吸附和底物结合的作用,采用了定点突变和单分子层技术相结合的方法对盖子结构的疏水氨基酸在催化过程中的作用进行研究。主要研究内容为以下五个方面:一、脂肪酶T1的基因克隆、表达和纯化。从NCBI数据库中获得了脂肪酶T1的全长基因序列并由公司合成。将构建的脂肪酶T1表达载体pET23a-CBD-T1转化到大肠表达菌株E.coli BL21（DE3）中,在20℃、1 mM IPTG条件下诱导表达12小时后获得目的蛋白,釆用载体自带的纤维素结合域CBD标签进行亲和层析纯化,获得高纯度的脂肪酶T1蛋白。二、将单分子层技术和经典乳液法相结合测定脂肪酶底物选择性的方法。将脂肪酶T1和脂肪酶PLA1、RML和HIL作对比,系统地研究脂肪酶T1的底物选择性。将单分子层技术测定脂肪酶动力学的方法,与经典的乳液法测定脂肪酶动力学的方法相比较。研究发现,四种脂肪酶T1、PLA1、RML和HIL在三油酸酰甘油酯单分子膜上都具有较高的脂肪酶酶活,但是只有PLA1在大豆卵磷脂单分子层膜上具有较高的磷脂酶活力,脂肪酶T1、RML和HIL具有较低磷脂酶活力。采用经典的乳液法测定脂肪动力学的结果和LB膜技术测定脂肪酶动力学的结果达成一致。三、脂肪酶T1结构分析和突变点的选择。将脂肪酶T1与I.5家族中脂肪酶进行序列比对和结构分析。结果表明,脂肪酶T1的氨基酸序列和I.5脂肪酶家族中其它脂肪酶具有高的同源性和相似性,其中盖子结构区域的氨基酸序列保持高度一致。在脂肪酶T1的闭合结构和来源于Geobacillus thermocatenulatus脂肪酶BLT2开放结构对比的研究发现,组成盖子a6螺旋的氨基酸发生了重新组合。采用定点突变试剂盒以pET23a-CBD-T1质粒为模板,分别将盖子区域中的疏水氨基酸突变成与其大小相似的亲水性氨基酸（F176Y,F181Y,L183N,A186S,V187N,A190S）。重组表达后,釆用纤维素结合域CBD标签进行亲和层析纯化,经过一步阴离子交换层析方法获得高纯度的脂肪酶T1突变体。四、采用单分子层技术研究了野生型脂肪酶T1及其突变体在大豆卵磷脂-水界面上的吸附动力学。基于Langmuir吸附数学模型,计算获得界面吸附常数、界面解析常数和吸附动态平衡常数。结果表明,在所有的突变体中,F181Y,L183N,A186S,V187N的吸附常数减小,而解析常数（kd）基本不变。所以,这导致了F181Y,L183N,A186S,V187N的吸附平衡常数减小。这些常数进一步推导可得脂肪酶的界面浓度GE*（moles cm-2）、界面酶百分比ΦE*%（mol%）和理论分子面积AE*（?2moles-1）。结果发现,酶吸附到界面的百分比（ΦE*）和界面上酶浓度（GE*）与脂肪酶对PC-水界面吸附的平衡常数（KAds）趋势保持一致。单分子酶在界面上占有的理论面积（AE*）增加。基于以上结论,我们提出一个脂肪酶T1在界面上的吸附模型:在盖子结构的6螺旋中,氨基酸残基F181,L183,A186,V187为非常关键的界面识别位点,并且与疏水界面起锚定作用,与界面的疏水相互作用减弱,影响酶分子在界面上的稳定性,从而影响酶分子在界面上的浓度。五、盖子区域疏水氨基酸影响脂肪酶T1水解活力机制。进一步研究盖子结构中的疏水氨基酸对催化过程产生的影响,并且系统地解释了盖子结构中的疏水氨基酸在催化过程对底物相互结合起到的作用。pNPB浓度对脂肪酶活力的影响的研究发现,脂肪酶T1及其突变体具有典型的“界面激活”现象。采用同源建模的方法建立脂肪酶T1的开放结构发现中突变点没有影响脂肪酶T1的起稳定蛋白的相互作用。釆用Discovery Studio的软件中的柔性对接模块,将小分子底物与脂肪酶的开放结构进行分子对接,发现氨基酸残基Leu183和Val187参与了底物1,2-二月桂酸甘油酯的结合。通过单分子技术测定在1,2-二月桂酸甘油酯上的脂肪酶活力发现,突变体L183N和V187N的水解活力降低。可能是因为氨基酸残基Leu183和Val187在影响界面吸附的同时,也参与了脂肪酶T1与底物的结合。