缺血性脑卒中是常见的心脑血管疾病,具有“高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率”的特点。该疾病严重威胁人类健康,给家庭和社会造成沉重的负担。然而,目前可用于临床的治疗药物却十分局限。因此寻找抗缺血性脑卒中的神经保护剂十分必要。本论文采用细胞表型筛选的方式,从已上市药物、化学合成小分子以及天然产物中寻找抗脑缺血损伤的新型、高效、机制新颖的活性化合物。本论文的第一部分内容是抗真菌药物环吡酮胺的抗脑缺血作用发现、药效评价及药理机制研究。首先应用模拟临床脑缺血再灌注损伤的快速表型筛选模型——氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)损伤SH-SY5Y细胞模型,对778个已上市药物进行活性测试,发现抗真菌药物环吡酮胺具有显著对抗缺血诱发神经细胞损伤的作用。环吡酮胺是抗真菌药物,临床上广泛用于治疗表皮真菌感染,其对抗脑缺血再灌注诱发的神经损伤作用尚未有文献报道。论文首先证实环吡酮胺浓度依赖地改善氧糖剥夺以及氧化应激诱发SH-SY5Y神经细胞损伤。在大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型中,再灌注时静脉给予环吡酮胺显著降低脑缺血再灌注24小时大鼠脑梗死面积,减轻脑水肿,并改善其神经功能。环吡酮胺连续7天给药对脑缺血再灌注大鼠运动功能的改善作用显著优于再灌注时单次给药的作用。与已上市药物依达拉奉相比,环吡酮胺在起效剂量和药效强度上均具有优势。论文进一步证实环吡酮胺对缺血诱发的神经细胞凋亡、炎症反应、血脑屏障破坏等多重病理环节具有干预作用,具体表现为:Tunel和蛋白质免疫印迹实验发现其显著抑制缺血损伤半脑内神经细胞凋亡;免疫组织荧光染色和酶联免疫吸附实验证实其显著抑制缺血半脑内胶质细胞激活和炎症细胞因子的表达;埃文斯蓝渗出实验及蛋白质免疫印迹实验发现其显著保护缺血再灌注损伤后血脑屏障,上调血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达。论文进一步结合环吡酮胺已报道的药物靶标开展抗缺血药效关联性研究,并采用抗体芯片、磷酸化蛋白质组学、活细胞光交联联合click反应进行生物素标记等手段对环吡酮胺的抗缺血药理机制和靶标进行探索研究。环吡酮胺对细胞内HIF-1α具有调控作用,但是其抗缺血诱发神经细胞损伤不依赖于其对HIF-1α的调控。磷酸化抗体芯片检测结果显示环吡酮胺调节与细胞存活和凋亡密切相关的AKT/GSK-3β信号通路。磷酸化蛋白质组学的研究结果显示环吡酮胺显著调控丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路蛋白以及细胞周期调控蛋白的磷酸化水平。进一步采用流式细胞术验证了环吡酮胺对胶质细胞的细胞周期有显著调控作用,并提示环吡酮胺可能通过该调控作用发挥对胶质细胞炎症反应的抑制作用。此外,论文结合运用具有显著体外抗缺血作用的连接光敏基团的环吡酮胺分子探针和靶标垂钓手段,初步开展了环吡酮胺抗缺血损伤的靶标蛋白研究,其直接作用靶标还有待进一步探索。本论文的第二部分采用快速细胞表型筛选模型完成414个化学合成小分子药物和232个天然产物抗缺血活性筛选,发现二芳基酰腙类系列衍生物具有显著对抗OGD诱发SH-SY5Y细胞损伤作用,其中化合物A11是药效最强的活性小分子之一。体外研究证实A11在三种缺血性脑卒中的细胞模型——氧糖剥夺模型,氧化应激模型及谷氨酸损伤模型中均表现浓度依赖的神经保护作用。体内研究应用大鼠大脑中动脉栓塞模型证实再灌注时静脉给予A11显著降低缺血大鼠脑梗死面积并改善其神经行为学功能。论文进一步发现A11有效对氧糖剥夺诱发的三种病理损伤——细胞凋亡、氧化应激以及线粒体功能紊乱,具体表现为抑制神经细胞内Caspase-3过度剪切、降低p53核内表达、降低ROS水平、上调ATP水平。机制研究发现A11显著上调OGD损伤后细胞内磷酸化AKT(protein kinase B)和磷酸化ERK(extracellular signal-regulated kinases)水平,采用工具药证实抑制AKT和ERK磷酸化水平上调可以阻断A11的抗氧糖缺乏损伤作用,提示A11的抗缺血损伤作用可能与激活PI3K/AKT和MEK/ERK相关。综上所述,本论文首次发现了已上市药物环吡酮胺和新型二芳基酰腙类衍生物A11具有对抗脑缺血损伤的药理作用。环吡酮胺显著对抗大鼠脑缺血再灌注诱发的多重病理损伤,并且具备改善缺血诱发神经细胞凋亡和抑制胶质细胞炎症反应的双重保护作用,具体机制可能与调控凋亡和细胞周期相关蛋白的磷酸化水平密切关联。二芳基酰腙类衍生物A11具有多重抗缺血损伤作用,其抗缺血诱发神经细胞损伤的药理机制可能与激活PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路密切关联。本论文的研究将为新型抗缺血性脑卒中神经保护剂的研发和关键药物靶标的发现和提供重要的线索和依据。