目的建立Sprague-Dawley(SD)大鼠糖尿病模型,通过伊文思蓝(evans blue,EB)灌注大鼠视网膜后在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中制作透明视网膜标本,直接在普通荧光显微镜下观察早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)血视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)功能的改变;通过玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)诱导的神经干细胞(neural stem cells,NSCs),观察其对DR大鼠BRB的影响。方法(1)40只雄性SD大鼠随机分为正常对照(CON)组10只大鼠和糖尿病组30只大鼠。腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病模型,根据病程,将糖尿病组大鼠分为糖尿病1个月(DM-1m)组、糖尿病3个月(DM-3m)组及糖尿病6个月(DM-6m)组;CON组大鼠腹腔注射等容量枸橼酸缓冲液。于各相应时间点经股静脉按45mg/kg注射30g/L的EB溶液,循环15min后摘除双侧眼球,立即置于PBS中完整剥离视网膜,放射状切开并平铺于载玻片上,避光晾至完全透明,封片,置于荧光显微镜下观察并拍照。应用IPP 6.0软件分析图像,测量并比较EB渗漏区面积与视网膜面积的百分比。(2)60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、DR模型对照组及NSCs治疗组,其中正常对照组12只大鼠,DR模型对照组及NSCs治疗组各24只大鼠。DR模型对照组和NSCs治疗组大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型。于糖尿病成模后3个月,NSCs治疗组大鼠右眼玻璃体腔注射2μl NSCs悬液(2×104/μl);DR模型对照组大鼠右眼注射等容量PBS;上述两组大鼠左眼及正常对照组大鼠双眼不给予任何干预。干预1个月后,采用EB灌注血管视网膜铺片观察视网膜血管形态及渗漏情况;EB定量检测BRB破坏情况;病理学切片观察视网膜组织改变情况。结果(1)糖尿病组大鼠较CON组血糖明显升高,体重明显下降(均P<0.05)。CON组大鼠视网膜血管形态和走形正常,红色荧光均匀充盈于血管腔。糖尿病成模1个月时,大鼠视网膜背景荧光较CON组略有增强;3个月时,背景荧光进一步增强,视网膜血管呈节段性扩张,可见明显的红色高荧光区;6个月时,视网膜血管粗细不均,部分走行迂曲,可见片状低灌注区及大量高荧光区。CON、DM-1m、DM-3m、DM-6m组EB渗漏区面积百分比分别为(0.05±0.02)%、(0.27±0.06)%、(1.17±0.18)%及(4.77±0.66)%,总体比较差异有统计学意义(F=795.800,P<0.000),其中DM-3m、6m组均明显高于CON组(q’=10.338,q’=43.475;均P<0.000)。(2)NSCs治疗组血糖较正常对照组明显升高、体重明显下降(P<0.05),与DR模型对照组无明显差异。EB灌注视网膜铺片检查显示,正常对照组大鼠视网膜血管无明显异常,无EB渗漏到血管外;DR模型对照组背景荧光增强,可见明显的EB渗漏高荧光区;NSCs治疗组背景荧光略增强,EB渗漏区较DR模型组明显减少。EB渗漏定量分析显示,DR模型对照组大鼠视网膜平均EB渗漏量较正常对照组增加(P<0.05);NSCs治疗组较DR模型对照组明显减少(P<0.05)。视网膜组织病理学检查示正常对照组视网膜各层结构清晰、排列整齐、形态正常;DR模型对照组视网膜细胞排列较紊乱,神经纤维层高度水肿,细胞核肿胀、体积增大,细胞密度降低;NSCs治疗组视网膜细胞较DR模型对照组略整齐,神经纤维层水肿明显减轻。结论(1)EB灌注大鼠视网膜后在PBS中制作透明视网膜标本的方法,可在普通荧光显微镜下获得清晰的大鼠视网膜荧光显微镜像;(2)STZ诱导的糖尿病大鼠模型成模3个月时可作为早期DR模型用于实验研究;(3)通过玻璃体腔移植h UCMSCs诱导的NSCs,能够改善BRB功能,减少早期DR大鼠血管渗漏,从而达到防治DR进展的治疗作用。