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背景目前认为,母体感染所继发的宫内感染是胎儿罹患神经系统畸形的主要原因,病毒和细菌感染致流产和新生儿出生后神经功能障碍的病例多有报道,因此,慢性脑内炎症反应有可能是其相关重要病理特征之一,而小胶质细胞近年来已成为研究神经系统炎症的一个热点。小胶质细胞是一种非常敏感的细胞,神经系统中极其微小的病变就可以引起小胶质细胞的激活,活化的小胶质细胞可以释放多种细胞因子,如TNF-α、 IL-1β等,在脑内炎症中起到损伤作用。小胶质细胞的激活机制可能与EGFR通路(Epithelial growthfactor receptor pathway)有关,EGFR通路中的某种信号转导途径可能促进小胶质细胞活化,从而使活化的小胶质细胞释放相关炎性因子,进而造成中枢神经系统损害。LPS是最常用最经典的致炎剂,是小胶质细胞确定的活化因子之一,多次用来制作神经细胞的炎性损伤模型。C225是EGFR的特异性单克隆抗体,可以通过免疫结合抑制EGFR通路活化,故应用其作为EGFR抑制剂创建本研究的干预组。本实验通过制作宫内感染动物模型探讨了EGFR通路的活化对小胶质细胞的激活机制的影响,抑制EGFR通路后小胶质细胞的活化程度,以及EGFR抑制剂对宫内感染所致炎症相关性中枢神经系统损伤和损伤后修复的影响。目的本研究拟通过建立孕鼠LPS动物模型,将孕鼠随机分组并分别给予C225或等量生理盐水进行干预后,腹腔注射LPS模拟孕鼠宫内炎症,通过形态学及分子生物学等手段检测EGFR通路对小胶质细胞的激活机制以及其相关下游炎症因子水平变化的影响,观察EGFR抑制剂对宫内感染仔鼠脑组织炎症反应影响。探究了EGFR通路在活化小胶质细胞相关炎症中的作用和抑制EGFR通路后对小胶质细胞激活造成的影响,以及EGFR抑制剂对宫内感染所致炎症相关性中枢神经系统损伤和损伤后修复的关系。方法将雌性大鼠80只与雄性大鼠40只于20时以2：1合笼,次日上午8时查阴道涂片,以查得精子为妊娠第1天,孕鼠另笼饲养。将上述孕鼠随机分为干预组(C225+LPS组)、模型组(LPS组)和对照组(NS组)。脂多糖冻干粉制剂溶于灭菌生理盐水配制成1g/ml和0.5g/ml两种规格,振荡混匀,4-C保存备用。每组取妊娠14天的大鼠,向模型组孕鼠腹腔注射浓度为0.5g/ml的脂多糖溶液0.2m1,向干预组孕鼠腹腔注射浓度1g/ml的脂多糖溶液0.1ml,同时注射含250 nM C225的生理盐水0.1ml,向对照组孕鼠腹腔注射生理盐水0.2m1,均连续注射5天。每组随机取6只新生仔鼠,饲养至28天,通过简化Morris水迷宫测试,了解其学习与记忆能力；分别取生后1、3、5天新生鼠,称重后一部分做脑组织石蜡切片,一部分直接断头取脑,留取新鲜脑组织标本,先液氮保存,次日转入-80℃冰箱保存备用。进行TTC染色,观察脑组织大体形态。进行HE染色,观察其病理变化。用免疫组织化学法检测OX42和磷酸化表皮生长因子受体(Phosphorylation of growth factor receptor, pEGFR)的表达。ELISA法检测小胶质细胞活化产物TNF-a及IL-1p的表达水平。另各组孕鼠留取其胎盘,行HE染色观察其病理变化。SPSS19.0进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.相同时间点相比,模型组所产新生大鼠体重较干预组及对照组新生大鼠均低,差异有统计学意义(P<0.05),对照组所产新生大鼠与干预组相比,体重较大,差异有统计学意义(P<0.05),且对照组及干预组所产新生大鼠体重增长较模型组快,模型组与干预组所产大鼠体重增长趋势相当。水迷宫测试结果提示模型组所产仔鼠平均逃逸潜伏期较干预组及对照组长,差异均有统计学意义(P<0.05),而干预组较对照组长,差异有统计学意义(P<0.05)。2.TTC染色显示模型组孕鼠所产大鼠脑组织可见损伤病灶,脑组织HE染色显示,模型组孕鼠所产新生大鼠脑组织细胞水肿、细胞排列紊乱,并伴有神经元的消失；干预组脑细胞仍可见正常的结构,细胞层次尚分明,部分可见少量炎细胞浸润；对照组脑组织结构清楚,细胞层次分明。模型组及干预组孕鼠胎盘HE染色结果显示有中性粒细胞浸润,对照组孕鼠胎盘结构清晰,无中性粒细胞浸润等炎症反应。3.免疫组织化学法结果显示,模型组、干预组所产大鼠脑组织内OX42及pEGFR标记阳性细胞表达量多于对照组所产新生大鼠,差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组OX42及pEGFR阳性表达量明显强于干预组,差异有统计学意义(P<0.05)。组内比较,模型组3天组及5天组与1天组相比,OX42及pEGFR阳性表达量相对多,差异有统计学意义(P<0.05)；模型组3天组与5天组相比,OX42及pEGFR阳性表达量相当,差异无统计学意义(P>0.05)。而干预组及对照组组内对比,OX42及pEGFR在各时间点的阳性表达量无差异(P>0.05)。4. ELISA法结果显示模型组孕鼠所产大鼠脑组织TNF-α及IL-1β含量较干预组及对照组均明显高(P<0.05),差异有统计学意义。干预组所产大鼠脑内TNF-α含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。而干预组所产大鼠脑内IL-1p含量与对照组相当,差异无统计学意义(P>0.05)。各组组内比较,模型组3天组及5天组与1天组相比,TNF-α及IL-1p含量相对多,差异有统计学意义(P<0.05),而3天组及5天组无差别；而干预组及对照组组内对比,TNF-α及IL-1β含量在各时间点含量无差异(P>0.05)。小结1.通过对模型组孕鼠所产大鼠体重监测及损伤脑组织的病理学观察证实宫内感染孕鼠模型制作成功；2.干预组仔鼠脑组织OX42阳性小胶质细胞的表达以及TNF-α、IL-1β的含量均低于模型组仔鼠脑组织,推测EGFR通路参与小胶质细胞的活化过程；3.利用EGFR抑制剂C225对宫内感染孕鼠模型进行干预可减轻仔鼠脑组织损伤程度,起到了神经保护作用；4. EGFR抑制剂C225可能会降低宫内炎症暴露后的仔鼠脑损伤的发生率。