鲟分枝杆菌病和罗非鱼无乳链球菌病及其分子流行病学研究

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鲟鱼(sturgeon)是世界上个体最大的硬骨鱼类之一,也是世界上现存鱼类中最古老的种类之一。随着鲟鱼养殖技术的普及和推广,我国的鲟鱼养殖业得到了巨大的发展。然而,细菌性疾病仍然是困扰我国鲟鱼大规模养殖的重要原因之一。近年来,我国多个地区暴发了鲟鱼分枝杆菌病。虽然鱼类分枝杆菌病已经有着深入的研究,但是有关鲟分枝杆菌病的研究资料十分匮乏。本文对我国人工养殖鲟鱼的分枝杆菌病进行了病原生物学研究。2009至2010年间,我国人工养殖的史氏鲟、中华鲟以及杂交鲟出现了大量的死亡。通过对患病鲟鱼的症状诊断、病原菌的分离鉴定和组织中病原菌的分子生物学检测,结果表明患病鲟鱼的病原菌是分枝杆菌。从19条患病鲟鱼中分离到49株共7种分枝杆菌,它们分别是海分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、猪分枝杆菌和Mycobacteriumarupense。本研究中发现患病鲟鱼主要是由分枝杆菌复合感染引起,检测的19条患病鲟鱼中有18条鲟鱼为分枝杆菌复合感染(94.7%),而且在分枝杆菌复合感染的鲟鱼中有17条鲟鱼检测到海分枝杆菌(89.5%)。分离菌株的斑马鱼攻毒试验结果表明海分枝杆菌的毒力最强,龟分枝杆菌的毒力最低。研究结果表明海分枝杆菌是鲟分枝杆菌病的主要致病菌。本研究是首次报道了中华鲟和史氏鲟的分枝杆菌病,并且是首次在鱼类中分离到猪分枝杆菌和M.arupense。   为了研究海分枝杆菌对鲟鱼的致病机理,进行了史氏鲟人工感染海分枝杆菌的转录组分析。通过史氏鲟人工感染海分枝杆菌的肝脏组织转录组测序,发现多个与疾病相关的表达差异显著的基因,这为研究海分枝杆菌的致病机理奠定了基础。   近年来,我国南方地区人工养殖的罗非鱼(tilapia)经常暴发链球菌病,这给罗非鱼养殖业带来巨大的经济损失,而无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是罗非鱼链球菌病的主要病原菌之一。2010年和2012年,广东省肇庆市人工养殖的罗非鱼暴发细菌性疾病。通过对患病罗非鱼的症状诊断和病原菌的分离、鉴定,结果表明34株病原菌均为无乳链球菌,而且这些病原菌对斑马鱼都有较强的致病力,这表明患病罗非鱼的病原菌是无乳链球菌。   本研究对我国南方地区的罗非鱼无乳链球菌进行了分子遗传特征研究。本研究收集了51株罗非鱼无乳链球菌,它们分别来自福建、广东、广西和海南等四个省份18个地区共27个池塘。通过多位点可变串联重复序列(Multiple-locusnumberoftandemrepeatanalysis,MLVA)分型、多位点序列分析(Multiple-locussequencetyping,MLST)分型、SmaⅠ酶切位点检测、可移动遗传元件(Mobilegeneticelements,MGE)检测、噬菌体DNA分型、分子血清型检测、表面蛋白抗原基因检测和多个毒力相关基因的检测等方法分析罗非鱼无乳链球菌的分子遗传特征。结果表明51株罗非鱼无乳链球菌具有相同的遗传类型,即Ⅰa-ST7-bca-bac-fbsA-sip-cfb-IS1381-IS861-ISSag2-GBSil,这些罗非鱼无乳链球菌具有高度相近的亲缘关系。在这些检测方法中,只有噬菌体分型将51株罗非鱼无乳链球菌分为两个型,即A型(8株,15.7%)和B型(43株,84.3%)。而且研究表明A型无乳链球菌主要在2010年之前流行,B型无乳链球菌在2010年之后流行,这为罗非鱼无乳链球菌病的流行病学研究、药物防治和疫苗研发奠定了基础。   根据链球菌recN基因设计了一对无乳链球菌特异引物,用于PCR快速检测罗非鱼无乳链球菌,这种方法检测罗非鱼无乳链球菌具有快速、准确和灵敏的特点。此外,构建了可高效分泌表达无乳链球菌表面免疫相关蛋白Sip(surfaceimmunogenicprotein)的活菌疫苗,这将有助于罗非鱼无乳链球菌的疫苗研制与应用。
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