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皱纹盘鲍是我国主要的海水养殖经济贝类之一。近年来病害频发等问题,使皱纹盘鲍养殖业蒙受了巨大的损失,对其可持续性发展构成了威胁。深入了解皱纹盘鲍的免疫机制,研究防御病害的有效方法,是目前亟待解决的问题。皱纹盘鲍缺乏获得性免疫,在抵御外源微生物入侵时主要依靠固有免疫。C型凝集素作为一种重要的模式识别受体,能够识别和清除多种外源微生物,在皱纹盘鲍的免疫防御中发挥着重要的作用。本实验运用现代分子生物学技术克隆得到了一个皱纹盘鲍C型凝集素基因(Hd CTL),并对其序列进行了生物学分析;检测了Hd CTL在皱纹盘鲍各组织中的分布,及其受到外源微生物后在皱纹盘鲍血细胞中的表达规律;构建了以Transetta感受态细胞为表达载体的原核表达系统,重组得到了r Hd CTL蛋白,并对r Hd CTL进行了活性分析;旨在初步探索Hd CTL在皱纹盘鲍免疫防御中发挥的作用,为进一步了解其固有免疫机制提供理论依据。本研究获得了皱纹盘鲍C型凝集素Hd CTL编码基因的c DNA,其全长为1933bp,包括5’端非编码区(UTR)9bp,3’端UTR 430bp,在3’端具有多聚腺苷酸加尾信号AATAAA,开放阅读框(ORF)1494bp,共编码497个氨基酸。Ex PASy预测其理论等电点为7.15,分子量为56.14k Da。所编码的氨基酸序列1(M)-25(F)为信号肽,31(R)-153(F)为CLECT结构域,196(W)-463(C)为Zona-pellucida结构域,经三维结构预测分析发现Hd CTL编码氨基酸含有C型凝集素结构域。利用实时荧光定量PCR技术检测了Hd CTL在皱纹盘鲍各组织的表达规律和经外源微生物刺激后Hd CTL在血细胞内的表达量。结果表明Hd CTL在肌肉、外套膜、鳃、血细胞、肝和性腺中都有表达,且在肌肉中的表达量最高,其次是血细胞,在鳃中的表达量最低。经鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,Hd CTL在血细胞中的表达量出现明显上升的趋势;在受到鳗弧菌刺激6h后,表达量显著上升;在24h表达量达到峰值;48h时表达量下降到最低。藤黄微球菌刺激后,也表现出被诱导表达的趋势。刺激6h后表达量显著升高;12h表达量下降,但在24h时显著升高而且达到峰值,高表达一直持续到48h。所以Hd CTL可能参与了皱纹盘鲍体内的免疫防御过程,在抵御不同外源微生物入侵过程中发挥作用。将Hd CTL编码区成熟肽克隆入Peasy-E1表达载体中,转化导入Transetta表达系统中,经IPTG诱导表达,利用镍螯合琼脂糖凝胶色谱法纯化出r Hd CTL重组蛋白,并利用梯度稀释法对重组蛋白进行复性,经复性蛋白免疫小白鼠,收集抗血清获得了抗r Hd CTL多克隆抗体,利用western-bolt对抗体进行特异性分析,结果显示抗r Hd CTL多克隆抗体能特异性识别r Hd CTL。酶联免疫吸附法(ELISA)检测了r Hd CTL对mannan、zymosan、LPS、PGN和β-glucan五种PAMPs的体外结合能力。r Hd CTL可以体外结合mannan和zymosan,对于zymosan的结合活性随着重组蛋白浓度的增加而增强,而对于LPS、PGN和β-glucan均无结合能力。这些结果说明Hd CTL编码蛋白可能介导皱纹盘鲍对于mannan和zymosan的免疫识别作用。进一步研究了r Hd CTL对于外源微生物的凝集活性。发现r Hd CTL对假丝酵母菌和毕赤酵母菌具有凝集活性,推测对mannan和zymosan识别是其凝集真菌等微生物的分子基础,表明Hd CTL可作为模式识别受体参与皱纹盘鲍对于外源微生物的免疫识别和免疫应答作用。检测了r Hd CTL对皱纹盘鲍血细胞吞噬作用和包囊化的促进作用。r Hd CTL能够促进皱纹盘鲍血细胞对于外源微生物的吞噬作用。利用镍琼脂糖颗粒检测r Hd CTL对皱纹盘鲍血细胞包囊化的促进作用中发现,表面包被了r Hd CTL的镍琼脂糖颗粒能够促进皱纹盘鲍血细胞在体外对琼脂糖颗粒的包囊化作用,这些结果表明r Hd CTL可能参与皱纹盘鲍对于外源微生物清除过程。综上所述,本研究克隆得到了一个皱纹盘鲍C型凝集素Hd CTL,并分析了其m RNA的表达规律和编码的蛋白特性。证明了r Hd CTL对mannan和zymosan有体外结合能力,并对假丝酵母菌和毕赤酵母菌等真菌具有凝集活性,同时证明了r Hd CTL可以促进血细胞对藤黄微球菌和鳗弧菌的吞噬和包囊化作用。研究结果丰富和发展了海洋无脊椎动物免疫学,为进一步研究软体动物的免疫机制提供了依据,为皱纹盘鲍抗病良种选育奠定了理论基础。