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研究目的主动脉壁持续性暴露于生物学及血流动力学的各种刺激中,这些刺激可能导致血管损伤。主动脉壁的自身修复不良可能促进主动脉瘤或夹层(aortic aneurysm and dissection, AAD)的发病。人们目前对AAD中自发的血管修复过程所知甚少。骨髓来源细胞(bone marrow-derived cell, BMDC)能迁移到受损的组织,起到组织修复作用。AKT信号通路是生物体内具有多种重要功能的信号通路,参与多利细胞功能的调控,如细胞代谢、细胞存活、细胞增殖、细胞迁移等,并且在心血管系统的发育和功能维护中发挥重要作用。研究报道AKT2在AAD的发病中起到保护作用,AKT2信号通路受损将增加AAD的易感性。本课题试图通过检测小鼠AAD模型中BMDC的募集、分化潜能以及生长因子的产生,发现和探讨BMDC在AAD发病和组织修复中的作用。为进一步研究其作用机制,我们选择AKT2为研究对象,通过动物实验和体外细胞实验,来探讨AKT信号通路在调节BMDC参与AAD发病及组织修复中作用。研究方法给野生型C57BL/6小鼠喂食高脂饲料(AAD模型组；n=20)或正常饲料(对照组；n=8),4周后给与致死剂量照射。提取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因小鼠的骨髓细胞,移植给经过照射的小鼠。移植后4周,通过皮下植入微泵,分别给与AAD模型组和对照组小鼠血管紧张素II或生理盐水。植入微泵4周后收取两组小鼠主动脉。通过免疫荧光染色观察BMDCs的募集、分化潜能以及生长因子的产生。为研究AKT2在调节BMDC参与AAD发病及组织修复中的作用,将Akt2基因敲除纯合子(Akt2-/-)小鼠与GFP转基因小鼠杂交,并让其后代继续杂交,经聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)基因型鉴定获得Akt-/-GFP转基因小鼠,用同前方法构建小鼠AAD模型,并做GFP+骨髓移植,以标记BMDC。受体均为C57BL/6野生型小鼠,供体骨髓分别来自于GFP转基因小鼠(WW组；n=14)和Akt2-/-GFP转基因小鼠(WA组；n=14)。通过主动脉形态学测量和组织切片,比较WW和WA两组小鼠AAD的发病率,明确AKT2是否参与调节BMDC在AAD发病及组织修复中的作用。通过组织化学染色明确WW和WA组的主动脉形态、组织结构有无明显区别。通过免疫荧光双标技术检测主动脉周围细胞的GFP与一系列细胞表面标记物的共表达,比较WW和WA两组中迁移到主动脉壁的BMDC的细胞类型、数量是否有区别,以揭示AKT2是否通过调节BMDC的分化或主动脉壁细胞构成来影响AAD发病。分离并原代培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和GFP转基因小鼠的或Akt2-/-GFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC),在体外分别共培养VSMC和这两种MSC (WT MSC或Akt2-/-MSC),并建立VSMC的氧化应激模型,用蛋白质免疫印迹(western blotting, WB)检测两种MSC及与之分别共培养的VSMC中的Wnt信号通路相关分子Wnt5和P-catenin,用体外细胞学实验探讨AKT2调节BMDC参与AAD发病及组织修复中的分子机制。通过免疫荧光双标技术、免疫印迹技术、实时定量PCR等方法,研究AAD患者主动脉组织中Notch信号通路相关分子的表达水平,了解Notch信号通路在AAD的发病及组织修复中是否有潜在的作用。结果骨髓移植后导致AAD模型组和对照组各有1只小鼠死于移植失败,其余小鼠均获得移植成功,GFP+细胞取代了受体的全部骨髓细胞。AAD模型组小鼠中37%(11/19)发生了AAD,并且在该组小鼠中,募集到主动脉壁的BMDC明显多于对照组,以AAD发病的区域更为显著。虽然在AMD模型组小鼠的主动脉中未能检测到BMDC分化为平滑肌细胞,但我们检测到了大量的骨髓来源的Sca-1+干/始祖细胞,NG2+的周细胞,FSP-1+的成纤维细胞以及CD68+的巨噬细胞。此外,在AAD模型组小鼠主动脉中,我们检测到了Sca-1+BMDC分别与NG2, FSP-1,或CD68共表达,提示Sca-1+BMDC可分化为周细胞,成纤维细胞以及巨噬细胞。而且,包括骨髓来源的Sca-1+干/始祖细胞在内的BMDC能够产生多种血管生长因子,如胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF),血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF),以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。我们成功杂交获得了Akt2-/-GFP转基因小鼠,并提取其骨髓细胞作为WA组的供体移植物。移植了Akt2-/-骨髓细胞的WA组小鼠AAD发病率明显高于移植了正常骨髓细胞的WW组(64%vs.0%),且WA组未发病的小鼠主动脉中膜变薄,发生AAD的小鼠主动脉中层厚薄不均,弹力蛋白排列紊乱、断裂或变平直。免疫荧光结果显示WA组迁移至主动脉的BMDC少于WW组,且主动脉壁的细胞构成发生改变：WA组主动脉中NG2+周细胞、FSP-1+成纤维细胞所占比例少于WW组,CD68+巨噬细胞所占比例多于WW组,且WA组主动脉中NG2+BMDC少于WW组,原位的FSP-1+成纤维细胞少于WW组,CD68+巨噬细胞在BMDC中的比例高于WW组。另外,WA组主动脉中膜凋亡细胞多于WW组。体外细胞学实验发现,与Akt2-/-MSC共培养的VSMC凋亡多于与WT MSC共培养的VSMC,且不论是否存在氧化应激,Akt2-/-MSC产生Wnt5少于WT MSC,与Akt2-/-MSC共培养的VSMC中β-catenin少于与WT MSC共培养的VSMC。提示MSC中的AKT2能够通过Wnt-β-catenin信号通路影响VSMC的凋亡。通过对AAD患者主动脉样本的研究,我们发现在AAD患者主动脉中膜的VSMC中,Notch信号通路是下调的,而在CD34+及Stro-1+干/始祖细胞、成纤维细胞以及巨噬细胞中则是上调的。结论在AAD中,主动脉损伤能够诱导BMDC迁移至主动脉,并分化为巨噬细胞、周细胞或成纤维细胞,参与主动脉的炎症、修复及重塑过程,并能分泌各种生长因子,为组织修复创造良好的微环境。BMDC中的AKT2能影响主动脉壁的细胞构成比例,BMDC中的AKT2缺陷能使主动脉周围周细胞及成纤维细胞比例下降,巨噬细胞比例升高,并能通过Wnt-β-catenin信号通路影响VSMC的凋亡。可见AKT2在调节BMDC参与AAD发病及组织修复中发挥重要作用,有望成为治疗AAD的新的分子靶点。另外,Notch信号通路在AAD患者的主动脉中有改变,提示Notch信号通路在TAAD的主动脉炎症损伤及损伤后修复、组织重构中起到重要作用。