背景TRPM2（melastatin-related transient receptor potential）是非选择性的阳离子通道,它可以被H₂O₂激活,引起相关的神经元与小胶质细胞的死亡。大量的研究表明,TRPM2是一种与氧化应激相关的离子通道,将氧化应激与通道结合更有利于发现其潜在的靶向作用,从而为治疗与氧化应激相关的疾病提供理论依据。有机磷农药被广泛应用于农业,在日常生活中误食或自杀服毒,会引起急性中毒。目前对有机磷农药的毒性作用的研究主要集中在胆碱能神经元的功能上,但对非胆碱神经元及小胶质细胞上的研究较少。本课题旨在研究TRPM2在H₂O₂或有机磷代表药DDVP（敌敌畏）引起的神经元（SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞,其具有神经元特性）和小胶质细胞RM死亡中的作用,有利于全面了解有机磷的作用机制,为临床上治疗有机磷中毒提供新的依据。第一部分TRPM2过表达对H₂O₂或DDVP引起SH-SY5Y细胞死亡的影响目的:探究不同细胞密度下,TRPM2离子通道在低浓度的H₂O₂诱导野生型及TRPM2过表达SH-SY5Y细胞死亡的作用。探究TRPM2在不同浓度的H₂O₂或DDVP诱导的SH-SY5Y细胞死亡中的作用。方法:将细胞培养24小时后用不同浓度的H₂O₂和DDVP分别处理细胞24小时,使用CCK-8试剂盒检测细胞的存活率。结果:（1）给予低浓度的H₂O₂（0-100μM）处理后,SH-SY5Y及其过表达细胞系的存活率均下降且具有浓度依赖性,但不同的细胞密度不会造成细胞系存活率较大的改变;（2）给予低浓度H₂O₂（30,100μM）时,SH-SY5Y过表达细胞系存活率没有明显低于野生组细胞（SH-SY5Y细胞）的存活率,统计学差异不明显（P>0.05）;（3）当H₂O₂的浓度分别为300μM,400μM,500μM时,野生组（WT）的细胞存活率明显高于过表达组（OE）,且具有统计学差异（###P<0.001,##P<0.01,#P<0.05）.（4）当DDVP的浓度为100μM时,野生组（WT）的细胞存活率高于过表达组（OE）,且具有统计学差异（#P<0.05）结论:在低浓度的H₂O₂诱导下,不同的细胞密度对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞及其过表达细胞系的死亡中无明显作用;一定浓度下,TRPM2在H₂O₂或DDVP诱导的SH-SY5Y细胞及其过表达细胞系的死亡中发挥着作用。第二部分TRPM2敲除对H₂O₂或DDVP引起SH-SY5Y细胞死亡的影响目的:利用构建的TRPM2敲除细胞系与野生型的SH-SY5Y细胞,探究TRPM2在不同浓度的H₂O₂或DDVP诱导的敲除细胞系的死亡中的作用。方法:使用PI/HOCHEST染色检测细胞死亡率,CCK-8法检测细胞的存活率。结果:（1）不同浓度的H₂O₂处理后,细胞的存活率呈现浓度依赖性,敲除组的细胞存活率比野生型组细胞存活率高,但没有统计学差异（P>0.05）;（2）不同浓度的H₂O₂处理后,细胞的死亡率呈现浓度依赖性,当H₂O₂的浓度为100mM时敲除型组（KO）细胞的死亡率比野生型组（KO）的细胞死亡率低,且具有统计学差异（#P<0.05）（3）不同浓度的DDVP处理后,细胞的死亡率呈现浓度依赖性;在DDVP浓度为100mM时,敲除型组（KO）细胞的存活率比野生型组（WT）的细胞存活率高,且具有统计学差异（#P<0.05）;（4）DDVP诱导的SH-SY5Y细胞及敲除细胞系的死亡中,当DDVP的浓度为100mM时敲除型组（KO）细胞的死亡率比野生型组（KO）的细胞死亡率低,且具有统计学差异（#P<0.05）;结论:TRPM2在H₂O₂造成的SH-SY5Y细胞及其TRPM2敲除系死亡中发挥的作用不明显;在DDVP浓度为100mM时,TRPM2在DDVP诱导的SH-SY5Y敲除细胞系的死亡中发挥作用。第三部分DDVP引起RM小胶质细胞死亡及TRPM2发挥作用的探究目的:探究DDVP诱导的RM细胞死亡及TRPM2在其中发挥的作用。方法:使用CCK-8法和PI染色法分别检测小胶质细胞的存活率与死亡率,使用DCFH-DA检测小胶质细胞中的ROS水平,Mito Tracker荧光探针检测细胞中的线粒体的变化,及Lyso Tracker探针检测细胞中的溶酶体变化。结果:（1）随着DDVP浓度的升高,小胶质细胞的存活率降低,表现出了浓度的依赖性;在DDVP浓度为300mM时,小胶质细胞的存活率明显降低且具有统计学意义(n=3,bar=标准误,（*P<0.05）。（2）加入DDVP检测细胞内ROS,线粒体,溶酶体,发现细胞形态发生了改变,说明DDVP对诱导小胶质细胞的死亡有作用。DDVP使ROS增加,线粒体和溶酶体形态结构、荧光密度发生变化。（3）使用PARP及TRPM2抑制剂,DDVP的浓度为300mM,使用PJ34,DPQ,2-APB抑制剂后小胶质细胞的存活率下降,使用PJ34没有统计学差异,使用DPQ,2-APB具有统计学差异（*P<0.05）结论:DDVP能诱导RM细胞死亡及TRPM2在其中发挥作用