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妊娠滋养细胞疾病特指一组以胎盘滋养层细胞异常增殖及胎盘绒毛过度生长为主要特征的与妊娠异常相关的疾病,其中包括部分性葡萄胎和完全性葡萄胎以及由葡萄胎恶变转化成的妊娠滋养细胞肿瘤。统计学表明,约有9~20%的葡萄胎会恶化为滋养细胞肿瘤,滋养细胞肿瘤与胚胎的遗传基因相关,是一种特殊的人类肿瘤疾病,包括侵袭性葡萄胎、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤和上皮样滋养细胞肿瘤等。转录因子叉头框(Forkhead box,FOX)是调控哺乳动物细胞增殖、迁移、侵袭及血管生成的关键因子。当前已有研究发现FOXM1在肺癌、胰腺癌、胃癌和肝癌等实体肿瘤中表达量均存在不同程度的升高。在胚胎发育阶段,FOXM1通过对多种下游因子进行转录调控,促进细胞周期G1/S及G2/M的转化,从而促进细胞的增殖。FOXM1b可与血管内皮生长因子的启动子相结合,促进肿瘤形成的迁移、侵袭及血管生成等过程。然而,转录因子FOX家族的FOXOs亚族则在类似的生物过程中表现出相反的表达水平及调控趋势。例如:FOXO1和FOXO3在多种肿瘤中表达水平异常减少,并且当其发生磷酸化时可以抑制细胞周期蛋白及VEGF的表达。有研究表明FOXOs家族与FOXM1具有一段共有的调控序列,因此在下游因子的调控中可产生竞争性抑制。由于FOXOs/FOXM1之间具有这种特殊关系,因此它成为了肿瘤研究领域的关键靶点,如FOXM1抑制剂盐霉素A、硫丝链菌肽等已被证实可用于抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。一、目的本实验室研究发现FOXM1可调节绒毛滋养层细胞JAR的增殖和迁移,而FOXM1与滋养细胞异常增殖所引起的葡萄胎是否具有相关性尚未见报道。本课题拟收集临床葡萄胎、正常足月妊娠的胎盘及子宫内膜,免疫组化法分析转录因子FOXM1、FOXOs等在葡萄胎、正常足月妊娠的不同时期胎盘及子宫内表达情况;体外以人绒毛膜癌Be Wo、JAR细胞系检测FOXM1表达;通过重组FOXM1过表达质粒及si RNA-FOXM1干扰质粒调控FOXM1表达,而后对细胞周期相关蛋白(Cyclin D1、Cyclin E1)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)及肿瘤侵袭相关蛋白(VEGF、MMPs)的表达进行检测,并研究其对人绒毛膜癌细胞JAR的增殖、迁移和侵袭能力的影响;通过检测AKT,ERK信号通路变化,逐步明确FOXM1对葡萄胎增殖、迁移和侵袭能力的影响及分子机制。一、目的二、方法(一)分析转录因子FOXM1在葡萄胎、足月胎盘和子宫内膜组织的表达1.收集临床葡萄胎、足月胎盘和子宫内膜组织样本,石蜡包埋;2.利用免疫组化分析检测葡萄胎、足月胎盘和子宫内膜组织中FOXM1、FOXO1及FOXO3等表达情况;3.利用Western Blot、免疫荧光检测分析FOXM1在人绒毛膜癌Be Wo、JAR细胞中的表达水平及细胞定位;4.通过脂质体转染,将重组FOXM1的过表达质粒及si RNA-FOXM1干扰质粒导入至人绒毛膜癌细胞株JAR中,调节FOXM1的表达水平;5.通过CCK8法分析FOXM1表达的改变对JAR细胞生长增殖能力的影响;通过Western blot检测人绒毛膜癌细胞JAR中FOXM1的表达水平以及细胞周期相关蛋白(Cyclin D1、Cyclin E1)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)的表达量的变化;6.通过Transwell检测FOXM1表达改变对JAR细胞侵袭和迁移能力的影响;通过Western blot检测人绒毛膜癌细胞JAR中肿瘤侵袭相关蛋白(VEGF、MMPs)的表达量的变化;(二)AKT、ERK信号通路在葡萄胎中对转录因子FOXM1的调控机制的研究1.收集临床葡萄胎、足月胎盘和子宫内膜组织样本;2.通过免疫组化分析,检测葡萄胎、足月胎盘和子宫内膜组织中AKT、ERK等信号通路分子的表达情况;3.通过不同浓度AKT信号通路抑制剂LY294002对p-AKT进行下调处理;不同浓度的ERK信号通路抑制剂U0126对p-ERK进行下调处理。利用Western blot检测两抑制剂对人绒毛膜癌细胞JAR进行加药处理后,FOXM1的表达情况;4.利用Transwell实验分析AKT信号通路抑制剂LY294002和ERK信号通路抑制剂U0126对人绒毛膜癌细胞JAR侵袭和迁移能力的影响;通过CCK8检测其对JAR细胞增殖能力的影响;5.通过Western blot检测LY294002和U0126对FOXM1表达水平的影响及其对下游MMPs和VEGF的表达。三、结果(一)转录因子FOXM1、FOXO1及FOXO3与葡萄胎的增殖能力相关1.FOXM1在葡萄胎组织中表达最为显著,主要表达在绒毛滋养层、细胞滋养层及合胞体滋养层。FOXO1和FOXO3表达趋势较FOXM1相反;2.Western Blot实验结果显示,FOXM1在Be Wo细胞中的表达量明显高于JAR细胞;免疫荧光实验显示,FOXM1在JAR细胞中,主要表达在细胞质,而在Be Wo细胞中,细胞质与细胞核均有表达;3.Western Blot实验结果显示,JAR细胞转染FOXM1的过表达质粒后,FOXM1的表达量升高;转染FOXM1干扰质粒后,FOXM1的表达量降低;4.转染FOXM1过表达质粒,细胞周期相关蛋白(Cyclin D1、Cyclin E1)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)及肿瘤侵袭相关蛋白(VEGF、MMPs)的表达变化;JAR细胞的增殖、侵袭和迁移能力均获得提高,FOXM1在JAR细胞中的细胞质和细胞核内均有表达;转染FOXM1干扰质粒后,JAR细胞的增殖、侵袭和迁移能力均下降,FOXM1仅在JAR细胞中的细胞质内表达;5.转染FOXM1过表达质粒,JAR细胞中MMPs,VEGF的表达量均明显升高;转染FOXM1干扰质粒后,JAR细胞中MMPs,VEGF的表达量均明显降低。(二)AKT、ERK信号通路在葡萄胎中对转录因子FOXM1的调控机制的研究1.AKT、ERK在葡萄胎中表达水平最高,表达定位表明其在细胞滋养层、合胞体滋养层及绒毛滋养层的细胞质和细胞核内均有表达;2.AKT信号通路抑制剂LY294002和ERK信号通路抑制剂U0126在不同浓度下处理JAR细胞,发现其与FOXM1的表达水平相关,且与药物浓度呈剂量依赖性;3.AKT、ERK可通过调控FOXM1的表达,影响JAR细胞的增殖、侵袭和迁移;4.AKT、ERK可通过调控FOXM1的表达,影响JAR细胞中,MMPs和VEGF的表达。四、结论(一)转录因子FOXM1在葡萄胎增殖机制1.FOXM1在葡萄胎内有较高的表达并主要在绒毛滋养层、细胞滋养层和合胞体滋养层的细胞质中表达;2.FOXM1在人绒毛膜癌细胞中,调控细胞的增殖;3.FOXM1在人绒毛膜癌细胞中,调控细胞的侵袭和转移;4.FOXM1在人绒毛膜癌细胞中,调控MMPs和VEGF的表达。(二)AKT、ERK信号通路在葡萄胎中对转录因子FOXM1的调控机制1.AKT、ERK信号通路在葡萄胎中表达,主要在绒毛滋养层、细胞滋养层和合胞体滋养层的细胞核和细胞质内表达;2.AKT、ERK可调控FOXM1的表达,其信号通路抑制剂对FOXM1的调控呈剂量依赖性;3.AKT、ERK通过FOXM1调控JAR细胞的增殖、侵袭和转移;4.AKT、ERK通过FOXM1调控MMPs和VEGF的表达。