研究背景：亚临床甲状腺功能减退症,简称为亚临床甲减或者亚甲减(SCH),是一种临床上较为常见的隐匿性甲状腺疾病,其特点是血清甲状腺功能检测仅仅表现为促甲状腺激素(thyrotropin,TSH)增高,但游离甲状腺素尚在正常范围,是甲状腺机能减退障碍的早期阶段。亚临床甲减在成年人中患病率约为4-10%,且男女比例不均,女性患病率明显高于男性,女性：男性约为1：7。特别是在60岁以上妇女中亚甲减的患病率则高达20%。研究显示：亚临床甲减已呈流行趋势,且患病率持续增长,是继发性高血压和血脂异常的重要原因,是冠心病、脂肪肝等疾病的独立危险因素。由于亚临床甲减的发病率逐年递增及其潜在的危害性,目前亚甲减已经成为了一个不容忽视的全球性的健康问题。另外,大规模人群研究及本课题组前期的流行病学调查和临床研究显示：TSH与血胆固醇(Total cholesterol,TC)呈正相关,同时也与血甘油三酯(triglyceride,TG)呈正相关。亚甲减患者血清TSH水平升高常伴有血清胆固醇、甘油三酯显著升高,即使TSH在正常参考值范围内(0.5-3.5mlU/L),也与血TC及血TG存在显著的线性正相关关系(p均<0.001)。在3,664例甲功正常人群中的回顾性研究表明：校正甲状腺激素等混杂因素影响以后,TSH依然显示出与血胆固醇水平、血甘油三酯水平呈明显正相关。虽然上述资料显示亚临床甲减的进程中经常伴随着不同程度的脂代谢紊乱,但目前关于亚甲减脂代谢紊乱的分子机制的研究尚不完善。而肝脏在机体脂质代谢的进程中施展了中心作用,是脂代谢的主要器官。因此,我们将肝脏脂代谢情况作为研究亚甲减脂代谢紊乱的主要靶点。内质网在肝细胞中丰富表达,是脂质合成转录后修饰的关键场所。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是指不同因素导致的内质网内环境的内稳态失衡,导致其内质网中的错误折叠蛋白或者是未折叠蛋白的蓄积,引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。ER stress发生时,免疫球蛋白结合蛋白(bindingimmunoglobulin protein,BiP)与内质网腔上相应的应激传感器需肌醇激酶1α(inositol-requiring enzyme-1α,IRE1α),RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)和激活转录因子6α(activating transcription factor 6α，ATF6 α)分离,激发下游信号级联反应,激活3条信号通路IRE1α/XBP-1通路,PERK/eif2α/ATF4通路和ATF6α通路,导致多种疾病的发生。UPR最初被定义为保守的信号通路,主要用来维护体内内质网的稳态。但是,现在已经有大量研究表明,ER stress介导的信号通路的激活能够引发或者加重细胞能量代谢受损、凋亡、脂毒性、胰岛素抵抗和炎症的过程,这些病理过程都能够导致脂代谢相关疾病的发生发展,与糖尿病、心血管疾病和脂肪肝等脂代谢紊乱相关性疾病有着密切联系。SREBPs家族内成员是维护脂质稳态的核心调节因子,在脂质合成过程中展露枢纽作用。SREBPs是具有碱性-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix-leucine zipper,bHLHLZ)构造的转录因子,以非活性的前体形式结合在细胞内的内质网膜上。SREBPs家族成员之一的SREBP-1主要调节脂肪酸和甘油三酯代谢,SREBP-2则是调控胆固醇代谢和低密度脂蛋白受体(LDL receptor)的表达。在内质网中,SREBPs的活性主要受到SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein,SCAP)和胰岛素调控蛋白(insulinregulated proteins,Insigs)的调节。在不依赖胰岛素的状况下,无论哪种来源(钙稳态失调,糖基化紊乱或者是氧化还原状态失衡)的ER stress都能导致SREBP1c前体的快速裂解以及SREBP1c靶基因表达上调。而且,ERstress导致的SREBP s蛋白质水解活性增加能够加快内质网内Insigl流通,而Insigs过表达或积聚则会降低脂质合成。目前研究表明,ER stress能够通过上调脂质合成转录激活因子和脂质合成相关酶的表达来增强脂质生成和肝脏细胞中脂滴的形成。ER stress也能够上调其他脂质生成的相关转录因子(如ChREBP)的表达。持续长久的ER stress是代谢性疾病的重要影响因素。那么,ER stres s是否也参与到了亚甲减导致的脂质代谢紊乱中呢?迄今为止,尚未见相关报道。目前国际上常用的亚甲减动物模型都是采用手术切除或者电凝大鼠甲状腺的方式建立的,这两种建立方法都不可避免的对模型大鼠产生了侵入性的应激伤害,而且两者都对操作者有较高的手术技术要求。为了更好的研究亚临床甲减的病理生理学特点,建立一种合适的非侵入性的动物模型就显得尤为重要。本研究首先使用抗甲状腺药物他巴唑(MMI)成功建立了一种新型亚临床甲减小鼠型(SCH模型),然后评估了SCH模型小鼠全身代谢情况和脂代谢情况,在此基础上又观察了SCH模型小鼠肝脏ER stress反应,最后对E R stress在亚甲减脂代谢紊乱中的可能作用机制进行了探讨。研究目的：1.建立一种新型的SCH小鼠模型。2.评估SCH模型小鼠的全身代谢相关情况和脂代谢情况。3.评估亚SCH模型小鼠是否存在肝脏ER stress反应。4.探讨ER stress与SCH模型小鼠脂代谢的相关关系。研究方法：1.SCH模型小鼠建立方法：应用常用抗甲药物MMI(0.08mg/kg)饮水喂养C57BL/6小鼠,创立新型的SCH模型小鼠。MMI喂养12周,16周和20周时,采用I125。标记放射免疫方法检测小鼠的血清游离甲状腺素(FT4)和游离三点原氨酸(FT3)水平；采取Elisa的方法测验小鼠血清TSH情况评估小鼠的血清甲状腺功能。并检测血清谷丙转氨酶(ALT)和血清谷草转氨酶(AST)评估小鼠肝脏功能。2.代谢情况评估：用TSE PhenoMaster动物代谢测量分析系统(简称为动物代谢笼系统)评估小鼠的物理活动度、产热情况、二氧化碳产量(VC02)、耗氧量(V02)、呼吸商(RQ)、饮食和基础代谢率(BMR)等全身代谢情况。3.脂代谢情况检测：检验科检测小鼠血脂；组织胆固醇含量分析试剂盒和组织甘油三酯含量分析试剂盒检测小鼠肝脏组织脂质(胆固醇和甘油三酯)含量；菲律宾(Filipin)染色评估小鼠肝组织胆固醇积聚状况；油红O染色评估小鼠肝组织脂质积聚状况。Real-time PCR的方法检测小鼠重要脏器一一肝脏的脂质合成及脂代谢枢纽分子的表达状况。4.小鼠肝脏内质网应激情况检测：采取Western Blot法测验肝脏ER stress三条通路蛋白的表达状况：Bip的蛋白变化,磷酸化IRE1α和总IRE1α的蛋白水平变化,XBP1u(未剪接体形式)和XBP1s(剪接体形式)的蛋白水平程度变化,磷酸化的eif2α和总eif2α蛋白水平的变化,以及ATF6α的蛋白水平变化。5.细胞培养验证：不同浓度梯度的TSH和阳性对照衣霉素(TM,ER stress激动剂)培养HepG2细胞株6小时,观察TSH对HepG2细胞的直接作用,能否导致细胞ER stress反应。采取Western Blot法检验细胞中Bip的表达程度变化,磷酸化IRE1α和总IRE1α的表达程度变化,XBP1u(未剪接体形式)和XBP1s(剪接体形式)的表达程度变化。6.4-PBA改善SCH模型小鼠的脂代谢紊乱：4-苯基丁酸(4-PBA,内质网应激的化学阻断剂)注射亚临床甲减小鼠4周后,评估各组小鼠肝脏ER stress的情况,同时检测相关脂代谢情况和脂质代谢相关基因的表达情况。结果：1.SCH小鼠模型的建立：0.08 mg/kg·d MMI饮水喂养C57BL/6小鼠分别造模12周,16周,20周时,取血检验小鼠血清甲功指标。发现在MMI喂养小鼠12周时,模型组小鼠血清FT4、FT3测值与对照组小鼠相比无明显差异性的变化(P>0.05)；血清TSH水平模型组明显高于对照组小鼠(P<0.05),差异具有统计学意义。上述变化符合亚临床甲减的临床特点和诊断标准,说明在MMI饮水喂养C57BL/6小鼠12周时,已经建立成了SCH模型。MMI喂养16周时,模型组小鼠仍然保持着亚临床甲减的状态。而在MMI喂养20周时,模型组小鼠血清FT4水平明显低于对照组小鼠(P<0.05),说明模型组小鼠进入临床甲减状态。MMI造模时,模型组小鼠亚甲减状态大约持续8周。2.SCH模型小鼠全身代谢情况评估：选用MMI喂养16周SCH模型小鼠,放入代谢笼系统监测其全身代谢情况。发现与对照组对比后,SCH模型小鼠的活动度、VCO2、VO2、RQ、产热量和BMR均无明显不同(P>0.05)。这与亚甲减病人临床特征相符：与甲状腺机能正常人对比,无明显代谢差异,不表现出明显的低代谢特点。3.SCH小鼠脂质代谢紊乱：与对照组相比,MMI喂养12周SCH模型小鼠的血脂谱和肝脏TC含量无显明差异；但此时肝脏甘油三酯含量增加(P<0.05)；肝组织切片油红O染色亦表明SCH模型小鼠脂质积聚较对照组增长。与对照组对比后发现,MMI喂养16周SCH模型小鼠血清TC,LDL-C和TG水平均有统计学意义地增长(P<0.05)；肝脏胆固醇含量(p<0.05)和肝脏甘油三酯含量(p<0.05)均明显增加；菲律宾(Filipin)染色和油红O染色结果也与上述数据相符合。PCR的结果显示,在SCH模型小鼠中,肝脏胆固醇合成关键基因SREBP2、HMGCR表达增高(P<0.05)而胆固醇转化主要因子CYP7A1、HNF4α的表达下降(P<0.05)；肝甘油三酯合成代谢关键基因SREBPIC和PPARα的nRNA表达上升(P<0.05),脂肪酸氧化限速酶CPT1α表达同样增强(P<0.05)。4.肝细胞ER stress’情况评估：SCH模型小鼠肝脏Bip、磷酸化IRE1α、及其下游XBPls(剪接体形式)的蛋白表达皆比对照小鼠组显明增长(P<0.05),而其他通路中关键分子则无明显变化。说明亚临床甲减能够激发小鼠肝脏ERstress，且可能主要是通过激发IRE1α/XBPls通路起作用。为了进一步说明ER stress是由TSH升高导致的,本研究又采用不同浓度TSH刺激HepG2细胞同时选用TM作为阳性对照,发现TSH刺激HepG2细胞6小时后,Bip、磷酸化IRE1 α、及其下游XBPls的蛋白表达均较对照组明显增加(P<0.05),且对于此种刺激作用存在有显著剂量依赖性的特点。5. ER stres s有可能于亚临床甲减中的脂代谢紊乱中施展枢纽作用：应用ERstress阻断剂4-PBA给SCH模型小鼠连续注射4周后,发现SCH模型小鼠的,脂代谢紊乱状态明显改善：血脂调整至正常程度,肝脏TC含量和肝脏TG含量也较未注射4-PBA的SCH小鼠显著下降(P<0.05),肝组织切片的菲律宾(Filipin)染色和油红O染色也与上述结果相一致。TG代谢和TC代谢的关键基因在分子转录水平也发生了相宜的程度变化。说明ER stress很可能在亚甲减伴随的脂代谢紊乱中发挥重要作用,当纠正了亚临床甲减的ERstress后,脂代谢紊乱明显改善。结论：1.应用MMI饮水喂养C57BL/6可以创立一种新型非侵入性、简单易行的SCH小鼠模型。2.伴着亚甲减的历程进展,经常会伴有脂代谢紊乱。在这个过程中,ER stress很可能发挥了重要的作用。3.纠正亚临床甲减的ER stress后,脂代谢紊乱得到明显改善。