花椒细菌性黑腐病病原鉴定、检测及其耐药机理研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yingying0615
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花椒是一种重要的生态经济树种,在我国栽培历史悠久。我国西南地区金沙江流域的山区由于土壤贫瘠,山体陡峭,水土流失严重,许多经济植物不适于栽植,但却很适合花椒生长。种植花椒既可发挥其保持水土的生态作用,又可拉动经济增长。在国家实施精准扶贫战略推动下,云南许多贫困山区花椒种植得到了各级政府的大力推广,并且成为低海拔山区农民重要的经济来源。自2018以来,云南省花椒种植面积最大的昭通市永善县等多地发生了危害严重的花椒果实黑腐病和叶斑病,使花椒大面积减产甚至绝收,造成当地花椒产业的巨大损失,病害发生突然,目前仍没有较好的防控措施。为了科学地防控该病害,本研究对病害进行调查、病原鉴定以及筛选防治药剂,建立病原快速检测体系,并对农药胁迫下的病原菌进行转录组测序分析,筛选重要病原的耐药相关基因。通过对该病害较完整的研究,以期为该病害科学防控提供前期基础资料,为后续深入研究奠定基础。主要研究结果如下:(1)通过调查研究明确了竹叶花椒细菌性黑腐病为国内外新病害,主要分布于云南省昭通市永善县,该病害主要危害花椒的果实和叶,且几乎只侵染竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)的永清一号品种。在6月初的高温气候条件下,病害进入危害的始盛期,果实和叶片出现褐色至黑色的近圆形斑点,病斑直径约0.5-3 mm,并逐渐扩大至整个果实和叶片,3-10 d内病害能完成大面积扩散,约3周后受害果实变黑干腐并随风脱落,调查发现该病害几乎只危害竹叶花椒(Z.armatum)永清一号,发病的鲁甸、巧家和永善三县中,永善县病害最严重,2019年已达到毁灭性灾害,最高发病率达96.7%,且病情指数达51.8。(2)通过病原学研究确定花椒果实黑腐病病原为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)和黄褐假单胞菌(P.fulva),而叶斑病病原仅为P.fulva,且病原致病性测试显示只有竹叶花椒为易感病品种。对400余份病害标本进行微生物分离共获得497株细菌菌株,经柯赫氏法则验证后获得致病菌385株,根据经形态学、生理生化测定和分子序列分析,确定栖稻假单胞菌(P.oryzihabitans)和黄褐假单胞菌(P.fulva)均为花椒细菌性黑腐病病原。P.oryzihabitans能引起油污状湿润型的黑果病,扩展迅速,而P.fulva则同时导致果实黑腐病和叶斑病,病斑干燥、无油污状,扩展较慢;P.oryzihabitans对果实的致病率、严重程度、发病速度均强于P.fulva。致病性测试结果显示,竹叶青花椒(Z.armatum)为易感病品种,发病率可达95%,九叶青花椒(Z.armatum var.novemfolius)具有一定的抗性,发病率低于14%,而大红袍(Z.bungeanum)和青花椒(Z.schinifolium)抗病性极高,发病率为0,该结果与田间调查结果一致。通过病害调查、病原菌鉴定和致病性测试,明确了目前病害发生区、病原种类以及感病寄主,为今后该病害的管控、花椒栽培选种和良种选育奠定基础。(3)通过对两种病原设计特异引 p4033-F/gp4033-R(P.oryzihabitans)和 gp8055-F/gp8055-R(P.fulva)构建了病原的快速检测体系。以两种病原菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gap1)基因差异设计特异性引物gp4033-F/gp4033-R(P.oryzihabitans)和gp8055-F/gp8055-R(P.fulva),通过 PCR、快捷型PCR和荧光定量PCR三种方法验证引物特异性和灵敏度。PCR检测中gp4033-F/gp4033-R对P.oryzihabitans灵敏度为100 pg/μL(DNA浓度),快捷型PCR检测灵敏度为104 CFU/mL(细菌浓度),荧光定量PCR检测的灵敏度为10-1 pg/μL(DNA浓度);PCR检测中gp8055-F/gp8055-R对P.fulva的灵敏度101 pg/μL,快捷型PCR检测灵敏度为104 CFU/mL,荧光定量PCR灵敏度为100 pg/μL,并且能完成田间样品检测。相比之下,PCR检测不仅快速而且灵敏度较高,该方法更适合投入生产实践。通过三种方法对比研究,建立了病原的快速检测体系,为该病害的快速检疫和流行学监测奠定基础。(4)通过抑菌圈法和比浊度法对37种杀菌剂进行筛选,获得抑菌效果最好的药剂为四霉素。采用抑菌圈法和比浊度法对37种杀菌剂抑菌效果进行测试,在LB平板打孔注入50 μL有效成分2 mg/mL的0.3%四霉素时,抑菌效果最佳,抑菌圈直径达58.3±1.2 mm(P.oryzihabitans)和 47.3±1.9 mm(P.fulva),其次是 3%的中生菌素和 72%的农用链霉素;LB培养基中比浊度法测试结果显示,0.3%四霉素抑菌效果依然最好,EC50=267 ng/L,EC90=23165 ng/L(P.oryzihabitans)和 EC50=10296 ng/L,EC90=1.4952×107 ng/L(P.fulva),其次是3%的中生菌素和25%的氨基·乙蒜素,抗生素类药剂对两种病原菌的抑菌效果均较好,铜制剂药剂抑菌效果较差甚至无效,P.fulva的耐药性明显强于P.oryzihabitans。通过杀菌剂筛选,大致了解两种病原菌对各类型杀菌剂的敏感性,为后续田间防治药剂选用和特异性杀菌剂研发奠定基础。(5)通过对四霉素胁迫下的主要病原(P.oryzihabitans)转录组研究,初步了解病原菌对四霉素的耐药机制。为了探究病原菌P.oryzihabintas对四霉素的耐药机制,通过P.oryzihabitans与四霉素共培养、提取RNA、建库测序和序列分析,共获得显著差异表达基因1446个,上调表达622个,下调表达824个。选取分析后的19条差异基因进行荧光定量PCR验证,结果显示供试基因差异表达程度与转录组测序结果一致,说明转录组测序合格可用。GO富集分析显示Biological Process,BP类型差异基因最多,共注释了 605条。KEGG富集分析显示Global and overview maps代谢通路最多,KEGG通路富集散点图最显著的是Ribosome,其次是Quorum sensing和Peptidoglycan biosynthesis and degradation proteins通路。通过转录组测序分析,明确了病原菌在药剂胁迫下的代谢差异,基本了解耐药的分子机制,为后续耐药基因筛选、药剂开发和花椒抗病良种选育奠定基础。(6)通过基因筛选、克隆、表达验证和功能测试,初步推测基因rpsJ和K07可能参与P.oryzihabitans耐四霉素的响应机制。为了进一步探索P.oryzihabitans响应四霉素胁迫的作用机制,选取转录组分析中特定表达的15个基因进行克隆验证,其中,rpsJ和K07基因能被稳定克隆并完成载体构建和转化,获得原装DH5α、空载DH5a、K07-DH5α和rpsJ-DH5α菌株,并测试阳菌株的耐药性,在LB固体培养基中原装DH5α的抑菌圈直径为32.6±1.0 mm,空载DH5α抑菌圈为32.7±1.4 mm,K07-DH5α的抑菌圈为31.3±1.6 mm,rpsJ-DH5α的抑菌圈为27.8±2.5 mm;LB液体培养基中EC50分别为491882 ng/L、493909 ng/L、524465 ng/L 和 611456 ng/L,K07 基因转化菌株表现极低的耐药相关性,而rpsJ基因转化菌株耐药性显著提升;为了进一步探索两个基因与P.oryzihabitans菌株的耐药相关性,参照转录组分析共培养方法,在改良的Richard培养基中以 8.57 ng/L、10.00 ng/L、12.00 ng/L、15.00 ng/L、20.07 ng/L(EC50)、30.00 ng/L和60.00 ng/L浓度四霉素进行胁迫培养,采用荧光定量PCR方法测定两个基因的相对表达量,在供试浓度范围内,二者于30.00 ng/L和60.00 ng/L达到相对表达量峰值,说明两个基因与P.oryzihabitans菌株响应四霉素胁迫的耐药机制存在一定的相关性。研究病原的耐药基因不仅能进一步了解病原菌的耐药机制,而且能为后续抗病选育、药剂改良及防控方案制定奠定基础。
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