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天然水蛭素是从医用水蛭的唾液腺分泌的一种小分子活性多肽,是目前己知的自然界中最强的抗凝血因子,可有效防治血栓性疾病。由于天然水蛭素原料有限,产量低,成本高,限制了其临床应用,从而采用基因工程技术开发重组水蛭素,可克服以上不足。随着基因工程在医药领域的深入应用,重组水蛭素在细菌和酵母中的表达得到迅速发展。毕赤酵母表达系统是用于表达外源蛋白的最理想的表达系统之一,目前已有400多种外源蛋白在该表达系统中得以成功表达。本文旨在构建多拷贝分泌表达载体及水蛭素高表达酵母菌株,并获得具有抗凝血酶活性的表达产物,为水蛭素的研究及临床应用奠定基础。我们利用全基因化学合成法合成欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)的水蛭素序列,克隆入毕赤酵母表达载体pA0815载体。毕赤酵母表达载体pA0815是Invitrogen公司开发的多拷贝胞内表达载体,可以通过提高整合入酵母细胞的外源基因拷贝数来提高外源蛋白的表达产量,但由于该载体缺乏分泌信号,其表达产物存在于酵母细胞内,因而容易被降解,降低了表达产量的同时也不利于表达产物的分离和纯化。为获得一个表达量更高、产物更易于分离纯化的表达系统,我们对pA0815和外源基因进行了巧妙的改造和构建。实验中我们用到两个载体pPIC9K和pA0815,这是目前应用非常广泛的酵母表达质粒,前者属分泌型质粒,其多克隆位点上游含有酵母α因子信号肽编码序列,表达产物可以分泌至胞外,极大简化了蛋白纯化方式；后者是胞内表达型质粒,提供构建多拷贝质粒的条件,使得表达载体在构建时即为多拷贝,大大提高了整合时产生多拷贝的几率,从而提高表达物的产量。我们首先合成水蛭素序列,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建pPIC9K-Hirudin重组质粒,然后从pPIC9K-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin片段插入到载体pA0815中,使重组表达载体pAO815-α-facor-Hirudin具备分泌信号从而由胞内表达变成分泌表达。最后通过酶切连接等方法体外构建pAO815-(α-factor-Hirudin)n多拷贝重组质粒,从而得到了多拷贝分泌型表达载体。构建的多拷贝重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,PCR筛选多拷贝表达菌株,经过甲醇诱导表达并优化表达条件,在30℃甲醇诱导120h的培养基中重组水蛭素的表达达到高峰。含尿素的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示培养基中含有单一的分子量为15kDa的蛋白条带,虽与计算的重组水蛭素7kDa的分子量不相符,但经分析和活性测定结果我们认为该条带为水蛭素的活性形式。活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血酶活性,抗凝活性达到1600ATU/ml。通过构建多拷贝分泌表达载体及水蛭素高表达酵母菌株,我们得到了分泌型的水蛭素高表达酵母菌株,并获得了具有抗凝血酶活性的表达产物,为水蛭素的研究及临床应用奠定了基础。