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嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae),是一类与小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocapsae)互惠共生的革兰氏阴性细菌,具有广谱的杀虫和抑菌活性,其分泌的杀虫毒素以及抑菌活性物质中包括几丁质酶和几丁质结合蛋白。为了明确嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白的特性和功能,本研究对其基因组中的几丁质酶基因和几丁质结合蛋白基因进行了生物信息学分析,通过原核表达获得了重组几丁质酶和几丁质结合蛋白,随后测定了重组几丁质酶和几丁质结合蛋白的生理生化特征以及生物活性,最后通过敲除几丁质酶基因Xn-chi60和Xn-chi70来了解这两种几丁质酶与Xn-Tc毒素的关系。现将主要结果总结如下:1.嗜线虫致病杆菌基因组中含有4个几丁质酶基因和1个几丁质结合蛋白基因,其编码的几丁质酶分别属于18家族几丁质酶和20家族几丁质酶。通过对GenBank中嗜线虫致病杆菌基因组进行分析,从中找到了 2个18家族几丁质酶基因 Xn-chi60和Xn-chi70(登录号:KC701470 和 KC701471)、2 个 20家族几丁质酶基因Xn-chi1 01和Xn-chi25(登录号:MT199128和MT219905)和1个几丁质结合蛋白基因Xn-cbp(登录号:KY817118)。通过生物信息学分析可知Xn-chi60基因序列全长为1608bp,编码535个氨基酸,蛋白质理论分子量为59.3kDa,等电点为4.51;Xn-chi70基因序列全长为1947bp,编码648个氨基酸,蛋白质理论分子量为72.4kDa,等电点为4.89;Xn-chi101基因序列全长为2700bp,编码899个氨基酸,蛋白质理论分子量为101.43kDa,等电点为6.94;Xn-chi25基因序列全长为678bp,编码225个氨基酸,蛋白质理论分子量为25.31kDa,等电点为10.21;Xn-cbp基因序列全长为600bp,编码199个氨基酸,蛋白质理论分子量为22.08kDa,等电点为8.00。这五种蛋白均为水溶性蛋白,都不含跨膜结构域,除Xn-Chi60和Xn-Chi70外,其余三种蛋白均含有信号肽。二级结构预测显示Xn-Chi60蛋白含有19个α螺旋和14个β折叠;Xn-Chi70蛋白含有24个α螺旋和20个β折叠;Xn-Chi101蛋白含有25个α螺旋和36个β折叠;Xn-Chi25蛋白含有8个α螺旋和6个β折叠;Xn-CBP蛋白含有4个α螺旋和7个β折叠。三级结构预测显示,Xn-Chi60和Xn-Chi70蛋白具有典型的(β/α)8双桶结构,属于18家族几丁质酶;Xn-Chi101和Xn-Chi25蛋白具有α/β桶形折叠,属于20家族几丁质酶。从进化图谱中可以看出18家族几丁质酶Xn-Chi60和Xn-Chi70来自于同一分支,20家族几丁质酶Xn-Chi101和Xn-Chi25来自于同一分支,Xn-CBP与致病杆菌属和发光杆菌属细菌的几丁质结合蛋白来自于一个分支。2.嗜线虫致病杆菌几丁质酶和几丁质结合蛋白基因的表达及重组蛋白的纯化。构建了Xn-chi101基因和Xn-cbp基因的原核表达载体pET-28a-chi101和pET-28a-cbp,分别将其转入到大肠杆菌(Es cherichi coli)Transetta(DE3)和 Trans BL21(DE3)中,成功表达出了重组蛋白Xn-Chi1 01和Xn-CBP。重组蛋白均以包涵体的形式存在,在诱导温度为28℃,IPTG浓度为0.5mmol/L时,包涵体表达量最高。经过对包涵体的变复性后,均得到了条带单一的可溶性蛋白。底物结合性试验结果表明,Xn-CBP对胶体几丁质的结合能力最强。3.明确了嗜线虫致病杆菌几丁质酶的酶学特性。利用DNS法对重组几丁质酶Xn-Chi60、Xn-Chi70和Xn-Chi101的酶学性质进行了检测。结果表明,Xn-Chi60的最适pH为6.0,最适温度为50℃,Ca2+、Cu2+、Fe3+、DTT、SDS和EDTA对该酶有抑制作用,Zn2+和Mn2+对该酶有促进作用;Xn-Chi70 的最适 pH 为 6.0,最适温度为 50℃,Ca2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、DTT、SDS和EDTA对该酶有抑制作用,Zn2+和Mn2+对该酶有促进作用;Xn-Chi101的最适pH为7.0,最适温度为40℃,Ca2+、Cu2+、Fe3+、DTT和SDS对该酶有抑制作用,Mg2+对该酶有促进作用。底物特异性以及酶动力学试验结果表明,三种几丁质酶均能特异性的结合胶体几丁质,且Xn-Chi70的结合能力高于Xn-Chi60和Xn-Chi101。4.重组几丁质酶和几丁质结合蛋白的杀虫和抑菌活性。杀虫活性结果表明,浓度为1mg/mL时,几丁质酶和几丁质结合蛋白对棉铃虫2龄幼虫的体重抑制率均达到80%以上。其中Xn-Chi70对棉铃虫的生长抑制作用最强,与Bt-Chi73类似,体重抑制率超过90%。不同的几丁质酶对Bt Cry1Ac毒素和Xn-Tc毒素增效作用差别较大,其中Xn-Chi70对Bt Cry1Ac毒素和Xn-Tc毒素的增效作用均最高,与Bt-Chi73类似。Xn-Chi101的增效作用不明显,Xn-Chi60和Xn-CBP无增效作用,但是Xn-CBP能提高几丁质酶对毒素的增效作用。抑菌活性结果表明,几丁质酶和几丁质结合蛋白对葡萄白腐病菌、棉花枯萎病菌、马铃薯早疫病菌和马铃薯黑痣病菌的菌丝生长和孢子萌发均有不同程度的抑制作用。总体来看,来自嗜线虫致病杆菌几丁质酶的抑菌活性明显低于来自苏云金芽孢杆菌的Bt-Chi73。5.明确了嗜线虫致病杆菌几丁质酶Xn-Chi60和Xn-Chi70与Xn-Tc毒素的关系。通过pJQ200SK自杀质粒敲除系统成功的筛选出了Xn-chi60单基因敲除株、Xn-chi70单基因敲除株以及Xn-chi60和Xn-chi70双基因敲除株。提取野生型菌株以及敲除株的Xn-Tc毒素进行杀虫活性测定,结果表明,Xn-chi60单基因敲除株、Xn-chi70单基因敲除株以及Xn-chi60和Xn-chi70双基因敲除株Xn-Tc毒素对棉铃虫的毒力较野生型菌株分别降低了 3.861倍、4.517倍和102.240倍。该结果说明这两个几丁质酶的存在对Xn-Tc毒素的毒力是不可或缺的。