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雄性生殖干细胞（mGSCs）的增殖与分化决定哺乳动物的精子发生的起始，mGSCs自我更新的维持是雄性动物精子持续并大量产生的基础。mGSCs的自我更新与增殖分化都是精密调控的有序循环过程，研究调控mGSCs的自我更新与增殖分化的因子对理解精子发生具有重要意义。早幼粒白血病锌指蛋白（PLZF）是一个同时包含9个锌指结构和一个BTB/POZ结构的锌指蛋白，它通过募集转录抑制共轭物来抑制靶基因的表达。在小鼠和人的研究中表明，PLZF能维持雄性生殖干细胞的自我更新，抑制细胞分化，它能与众多分化相关因子形成一个平衡调节网络，进而维持雄性生殖干细胞池的细胞数量稳定。miRNAs是当前生命各领域研究的热点之一，研究发现miRNAs在多种生物事件中扮演重要的调控角色，这些生物事件包括细胞增殖，分化和凋亡。探索miRNAs调节靶基因的转录，mRNA的稳定性以及翻译机制是阐明睾丸发育及雄性生殖干细胞自我更新与分化的一个重要的科学问题。miR-544是14q32miRNA-clusters中18个miRNA之一，在多种肿瘤中影响肿瘤细胞的增殖及细胞周期，可作为神经胶质瘤恶性转变恶性转变及急性成淋巴细胞性白血病诊断的标志之一。本研究以PLZF为研究主线，通过在线生物信息学数据库预测靶向PLZF的上游miR-544。在分离纯化的原代及传代mGSCs中共转染PLZF-3’UTR双荧光素酶报告基因野生型（或突变型）载体与miR-544模拟物（miR-544m）、抑制剂（miR-544i）及无义物（NC），对miR-544-PLZF信号通路调控mGSCs自我更新与分化作用进行研究，发现miR-544能通过靶向抑制PLZF而促进奶山羊mGSCs分化。1. PLZF调控mGSCs的自我更新我们通过免疫组化技术分别对30dpp,6月,10月三个年龄段的奶山羊睾丸进行PLZF表达检测，发现PLZF在6月龄的奶山羊睾丸中表达量最高，其后依次为30dpp和10月龄。利用NCBI数据库，通过电子克隆的方法获得奶山羊的PLZF全长序列并构建过表达载体pPLZF-IRES2-EGFP。在mGSCs中过表达PLZF，结合QRT-PCR,免疫荧光等实验技术检测自我更新与分化相关基因的变化，发现过表达PLZF组的细胞能较好的维持自我更新相关的基因PGFRa1、VASA、OCT4的表达，同时维持细胞较高的增殖能力（BRDU表达水平较高）。相反，在未转染PLZF组的细胞中上述基因则发生了明显表达丢失，增殖能力下降。验证了PLZF在一定程度上能抵抗高浓度血清引起的细胞分化从而初步证实PLZF能维持奶山羊雄性生殖干细胞自我更新。2.直接靶向PLZF的miRNA筛选及验证运用生物信息学软件Targetscan筛选出可能直接靶向PLZF的4个miRNAs—miR-544、miR-370、miR-874、miR-378，再通过初步的转染实验将以上4个miRNAs分别转染mGSCs并检测PLZF的表达，然后将挑出的miR-544、miR-378再分别与psiCHCEKTM-2-PLZF-3’UTR共转染到Hela细胞进行双荧光素酶检测进一步筛选出miR-544。最后再通过双荧光素酶将miR-544模拟物及无义物（NC）分别与psiCHCEKTM-2-PLZF-3’UTR及psiCHCEKTM-2-Mut-PLZF-3’UTR载体共转Hela细胞，结合Western blot试验验证PLZF为miR-544的靶标基因。3. miR-544在mGSCs自我更新调控中的作用mGSCs中转染miR-544的模拟物和抑制物后观察mGSCs的形态变化、凋亡样细胞出现的比例，再结合QRT-PCR, Western blot和流式细胞周期检测等实验技术检测自我更新与分化相关基因的变化。结果发现miR-544能使mGSCs细胞体积变大、凋亡样细胞明显增多，同时抑制雄性生殖干细胞自我更新相关的基因如PLZF、CXCR4和GFRa1而促进雄性生殖干细胞的分化相关的基因KIT、DAZL等的表达。以上结果表明，miR-544通过下调靶基因PLZF,促进奶山羊mGSCs的分化。