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Fgl2纤维介素基因(fibrinogen-like protein 2/fibroleukin)又名fgl2凝血酶原酶基因,简称fgl2基因,属纤维蛋白原相关蛋白超家族,主要由活化的巨噬细胞及内皮细胞产生。Fgl2有两种表型,跨膜型和分泌型。跨膜型fgl2主要的生物学活性类似于活化的凝血因子Xa,可直接催化凝血酶原转变为凝血酶,继而使纤维蛋白原转变为纤维蛋白,从而快速启动凝血途径。已有的研究表明fgl2与重型肝炎、自发性流产、同种及异种移植排斥反应等疾病的病情进展有密切关系。在MHV-3病毒感染的敏感小鼠体内,鼠纤维介素基因(mfgl2)高度表达,已证实MHV-3病毒的核心蛋白可以激活mfgl2的高度表达,且这种高度表达是通过体内转录因子HNF-4与mfgl2基因启动子调控区域的顺式作用元件位点结合导致了该基因的激活。在亚洲,乙型肝炎病毒(HBV)是引起人类重型肝炎的主要病因之一。HBV编码蛋白已被证实具有激活人体内多种基因的功能。以往研究表明,Fgl2基因的高度表达与鼠暴发性肝炎以及人类重型肝炎的发病有密切关系。为探讨HBV编码蛋白是否对人纤维介素基因(hfgl2)具有激活作用及其相关分子机制,我们进行了以下试验。首先,为研究HBV编码蛋白是否对hfgl2基因具有激活作用以及何种病毒蛋白发挥激活hfgl2基因的作用,我们构建了HBV编码蛋白HBc、HBs和HBx的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx,将其分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因表达质粒(β-Gal)共转染到CHO细胞和HepG2细胞,采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达。通过检测报告基因荧光素酶(LUC)及β半乳糖苷酶的表达活性,反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用。结果显示,转染了HBV病毒蛋白真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的HBV编码蛋白。相对荧光素酶的结果提示:在CHO细胞,转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组(即转染空载体pcDNA3.1组)的5.4和6倍,在HepG2细胞,转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍,表明HBc蛋白和HBx蛋白均具有激活hfgl2的功能,而HBs蛋白则不能激活。为研究HBV编码蛋白作用下参与hfgl2基因激活作用的转录因子及顺式作用元件,我们构建了一系列5’端缺失而保留共同3’端的hfgl2基因启动子虫荧光素酶报告质粒,将其分别与HBV编码蛋白HBc、和HBx的真核表达质粒进行共转染试验,即系列启动子缺失试验,结果表明:在hfgl2基因启动子-712位至-568位(相对于转录起始点)之间存在着激活该基因的调控序列。采用生物信息学方法分析,在hfgl2基因启动子的-712位至-568位之间存在着五个主要的候选转录因子结合位点,采用Quick-Change定点突变方法,将其突变形成hfgl2基因启动子突变质粒,经测序证实五个位点均突变成功。将hfgl2基因启动子突变质粒转染CHO细胞,发现在HBc作用下,重叠位点LEF-1/c-Ets-2的相对荧光素酶活性降低66%,而在HBx作用下,重叠位点LEF-1/c-Ets-2和HSTF的相对荧光素酶活性降低70%和60%,其他位点相对荧光素酶活性没有明显改变。凝胶迁移试验(EMSA)表明在病毒蛋白作用下,转录因子c-Ets-2能与hfgl2基因启动子上相关顺式作用元件结合从而激活该基因的表达,染色质免疫沉淀试验(ChiP)表明,与转录因子c-Ets-2结合的DNA位于hfgl2基因启动子部位,进一步证实c-Ets-2是激活该基因的必须的转录因子。共聚焦显微镜检测c-Ets-2在细胞内的表达,显示转染病毒蛋白HBc和HBx真核表达质粒后,在胞核及胞浆中均可见c-Ets-2基因的表达,其表达强度较对照组(转染空质粒组)以及转染HBs真核表达质粒组均明显增强,且有核转移的发生。Western blotting试验显示,转染病毒蛋白真核表达质粒pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组,胞核内c-Ets-2的表达较对照组明显增强,进一步说明了转录因子在病毒蛋白作用下有移位至核内的现象。采用RNA干扰的方法干预HepG2细胞中c-Ets-2的表达,结果显示,与未干预组相比,采用c-Ets-2 shRNA干扰质粒组hfgl2基因启动子荧光素酶的活性降低了64.8%,而采用无关序列的shRNA干扰质粒组荧光素酶的活性无明显改变,表明在病毒蛋白HBc和HBx作用下,转录因子c-Ets-2对激活hfgl2基因起重要作用。对于人类重型肝炎患者,采用共聚焦显微镜、Western blotting以及流式细胞仪等方法发现其外周血单个核细胞(PBMC)中c-Ets-2的表达较健康对照者明显增强。信号转导途径的研究表明,重型肝炎患者的P-JNK、P-p38 MAPK以及P-ERK的磷酸化水平较健康对照者明显增强,提示重型肝炎患者JNK、p38 MAPK以及ERK信号转导途径被激活。体外实验显示,转染了病毒蛋白HBc真核表达质粒的THP-1细胞其转录因子c-Ets-2的表达均明显高于未转染质粒的细胞,且c-Ets-2的表达能被ERK途径阻断剂PD098059所特异性阻断,提示在HBc作用下,c-Ets-2的表达依赖于ERK途径的激活。转染了病毒蛋白HBx真核表达质粒的细胞其转录因子c-Ets-2的表达均明显高于未转染质粒的细胞,且c-Ets-2的表达能被JNK途径阻断剂SP600125所特异性阻断,提示在HBx作用下,c-Ets-2的表达依赖于JNK途径的激活。以上结果说明,乙型肝炎病毒蛋白HBc及HBx分别通过激活JNK途径及ERK途径,继而激活转录因子c-Ets-2,使之移位至核内,并与hfgl2基因启动子上顺式作用元件结合上调了hfgl2基因的表达。本研究从病毒蛋白与宿主基因的相互作用角度进一步阐明了乙型重型肝炎hfgl2基因高度表达的分子机制,而c-Ets-2有可能成为此疾病干预的又一分子靶点。