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背景BICC1也称双尾C基因（Bicaudal-C）最早是在黑腹果蝇中研究发现,动物实验中破坏该蛋白可以干扰果蝇卵母细胞次级卵泡细胞的正常迁移方向。鼠BICC1基因同源于果蝇BICC1基因,BICC1在小鼠的功能还未明确,目前的研究发现突变小鼠BICC1基因与多囊肾疾病相关。小鼠BICC1蛋白包含3个KH域,其他包含KH域的蛋白和涉及果蝇、爪蟾的BICC1研究说明该结构域与RNA互动很重要。BICC1参与RNA的剪切与降解过程,并对一些器官如肾脏,胰腺等的形态、功能的维持中发挥重要作用。我们前期实验结果说明:相较于正常的人胰腺组织及胰腺组织中的导管细胞,在胰腺导管肿瘤腺癌患者的手术切除标本及胰腺肿瘤细胞系中的BICC1表达量明显上升。我们为进一步探索BICC1在肿瘤中的作用进一步设计了相关实验,我们探索了BICC1在胰腺肿瘤中高表达对患者生存预后意义的影响,以及BICC1高表达与各个临床病理参数的关系,其背后的调控机制,目的是从包括临床水平、细胞功能水平、分子生物学水平及动物实验水平深入探索胰腺导管腺癌中BICC1高表达的功能与意义。方法1.应用天津市肿瘤医院胰腺导管肿瘤腺癌组织石蜡标本,首先进行对BICC1及HIF1α的连续切片进行空间共定位染色,之后根据标准进行评分,从组织蛋白表达水平来分析两者是否具有相关性;再结合石蜡标本的病例生存及预后信息,将BICC1蛋白的表达水平与临床各个病理参数之间进行综合相关分析,并判断关联性大小。2.应用Wester Blot蛋白质印迹法（免疫印迹试验）、RT-QPCR实时定量PCR等常用经典分子生物学实验技术,检测本实验室常用的胰腺肿瘤细胞系中BICC1及HIF1α的表达情况并根据表达情况分别构建相关稳定过表达降表达细胞系;采用免疫荧光技术ImmunoFluorescence检测BICC1在胰腺肿瘤细胞中的空间定位。应用CHIP和双荧光素酶实验研究胰腺肿瘤细胞中HIF1α与BICC1表达相关性。3.应用常用标准分子克隆方法构建BICC1过表达质粒及BICC1 short hairpin RNA降表达质粒,构建慢病毒稳定转染系统,建立稳定转染细胞系;用蛋白质印迹法（免疫印迹试验）RT-PCR检测BICC1及HIF1α细胞稳系水平;细胞运动功能实验:采用划痕、迁移、侵袭检测细胞稳系降表达的BICC1的生物学功能。4.采用乏氧环境处理过表达及降表达BICC1稳系观察BICC1对胰腺肿瘤细胞在乏氧环境下对肿瘤细胞运动能力的影响。应用转录组测序RNA-sequence的方法筛选BICC1促进肿瘤转移的RNA靶标;应用蛋白质印迹法（免疫印迹试验）Western blot、RT-PCR实时定量PCR验证测序结果;通过阻断试验进一步确定BICC1对运动功能的作用。5.应用蛋白印迹法、定量PCR、免疫细胞荧光BICC1调控下游分子的机制。6.构建免疫缺陷小鼠原位成瘤模型;动物实验验证BICC1对胰腺癌肿瘤转移发挥的影响。结果1.BICC1在胰腺导管肿瘤腺癌PDAC及其对应癌旁正常胰腺组织IHC免疫组化染色表达强度及其含义。我们通过对天津市肿瘤医院搜集的120例手术标本经行石蜡切片的BICC1染色及其临床相关性分析,并从以上病例中分两次随机抽取其中8例手术配对标本进行蛋白质印迹法（免疫印迹试验）western blot和RT-PCR实时定量PCR发现,与人癌旁正常胰腺组织相比BICC1在胰腺肿瘤中表达量明显较高,且BICC1的表达水平与胰腺肿瘤患者的生存预后具有相关性,呈负相关（p=0.027）,我们同时还对来自与TCGA（The Cancer Genome Atlas）的数据进行了分析,结论与我们的免疫组化染色结果一致。我们进一步分析比较对BICC1表达水平与各项常用临床病理参数,结果发现BICC1与胰腺肿瘤大小,原发灶浸润情况T分期以及肿瘤细胞恶性程度G分期,无统计学差异;相反与淋巴结转移情况N分期,UICC-TNM分期有统计学差异。同样的,来自TCGA数据库的数据也给出了相同的答案,提示BICC1的表达情况与肿瘤T分期,肿瘤大小,以及肿瘤分化无相关性,与N分期及TNM分期具有统计学意义。以上信息提示我们BICC1影响胰腺癌肿瘤细胞的转移运动能力。2.BICC1通过调节胰腺肿瘤细胞的运动能力对胰腺癌的进展发生作用。我们根据BICC1在本实验室常用胰腺癌细胞系中的表达,成功构成了两个降表达BICC1的细胞稳系（BxPC-3与CFPAC-3）以及两个过表达BICC1的细胞系（BXPC3,AsPC-1）。根据之前免疫组化及TCGA数据库的结论支持,我们推测BICC1可能对肿瘤细胞的运动能力具有影响。我们将稳定过表达降表达及对照组细胞系进行常规培养后,进行了常规划痕实验Wound healing、迁移实验Migration、侵袭实验Invasion与对照组相比,BICC1过表达组无论是运动的距离还是迁移细胞数的多少都明显较高,反之与降表达相比其细胞的活动能力较差。用稳定过表达降表达及对照组细胞系在小鼠胰腺组织原位成瘤观察肿瘤的转移情况,发现过表达BICC1组与对照组相比,肿瘤发生肝脏转移的数目较多,且转移瘤的体积也更大,相应的降表达BICC1组体积较对照组转移数目较少。3.BICC1通过ZEB1调控胰腺肿瘤细胞的运动能力影响胰腺癌的进展。我们将降表达BICC1的胰腺癌细胞系BxPC-3进行转录组测序RNA-seq,并对结果进行了分析,发现ZEB1表达水平明显降低,两者在RNA表达水平具有相关性,且为正相关。而ZEB1是目前已知较强的可以影响肿瘤转移的因子之一。我们用蛋白质印迹法（免疫印迹试验）western blot和RT-PCR实时定量PCR分别检测了过表达及降表达BICC1稳系中的ZEB1表达情况,我们发现ZEB1确实与BICC1有同升共降的关系。这也验证了BICC1是通过ZEB1影响了肿瘤细胞的运动能力。4.BICC1受HIF1α的转录水平调控。低氧是所有实体肿瘤的共同的微环境特征,胰腺癌也是实体肿瘤,而HIF1α可以调控多种影响肿瘤生长,转移抗凋亡的基因。我们将本实验室常用的胰腺肿瘤细胞系进行乏氧处理,并进行了蛋白质印迹法（免疫印迹试验）western blot和RT-PCR实时定量PCR实验,结果说明在低氧环境下处理胰腺癌细胞系发现BICC1的表达明显上升。胰腺肿瘤低氧环境下发挥主要作用的是HIF1α,我们构建了HIF1α过表达降表达稳定过表达降表达细胞系,同样采用蛋白质印迹法（免疫印迹试验）western blot和RT-PCR实时定量PCR,BICC1在HIF1α稳系中,与HIF1α的表达情况一致。我们通过查阅通用数据库,分析预测BICC1启动子区存在可与HIF1α结合的结构域,我们设计蛋白质-染色质共沉淀CHIP和双荧光素酶报告liciferase report实验,结果证明HIF1α确实可以结合在BICC1的启动子区并起始BICC1的转录,增加BICC1的表达。5.BICC1表达与HIF1α表达具有相关性。我们再次通过将胰腺肿瘤手术患者石蜡标本连续切片,进行BICC1与HIF1α免疫组化染色,进行空间共定位,并进行染色强度和染色面积的评分,最终进行分级,以及通过TCGA数据库中胰腺癌及其他常见的数种肿瘤在RNA水平进行相关性分析,结果发现BICC1表达与HIF1α表达具有相关性,呈现正相关性。6.小鼠体内胰腺组织原位种殖瘤观察BICC1对胰腺癌转移影响。构建鼠源胰腺癌PanC02细胞系的过表达BICC1细胞系,过表达BICC1降表达ZEB1细胞系,将构建好的过表达BICC1细胞系及BICC1OE ZEB1KD细胞系进行小鼠胰腺组织原位成瘤,常规饲养条件,观察转移瘤情况。实验结果证明,小鼠体内胰腺组织原位成瘤后,过表达BICC1细胞系的肝脏转移瘤数目较对照组明显升高,敲除ZEB1后肝脏转移瘤数目较过表达BICC1组有所下降,实验发现BICC1通过调控ZEB1的表达,促进了肿瘤的转移。结论1.BICC1蛋白在胰腺癌组织中及胰腺肿瘤细胞系中异常高表达;胰腺肿瘤组织BICC1表达水平与患者预后呈负相关。2.BICC1过表达后将与ZEB1的mRNA结合,引起ZEB1表达增加,从而增强胰腺肿瘤细胞的迁移运动能力。通过促进肿瘤细胞运动能力,进而增强肿瘤的转移能力。3.HIF1α可以调控增加BICC1的转录,增加BICC1蛋白的水平,对于胰腺肿瘤细胞的转移运动能力发挥促进作用。