听力损失是影响世界上上亿人的最普遍的感官性疾病之一，其中50％以上是由遗传基因的突变或缺失引起的。截止到2015年，已经鉴定了141个与非综合征听力损失(NSHL)相关的基因位点，其中85个基因已被确定为耳聋基因。在新的测序技术帮助下，如大规模并行测序(MPS)和下一代测序分析(NGS)，预计会发现更多的耳聋基因。　　Ildr1基因的突变会引起常染色体隐性耳聋DFNB42。ILDR1属于Ⅰ型跨膜蛋白，其结构包括胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜区和胞内段结构域。ILDR1属于进化保守的Angulin蛋白家族，它有两个同源蛋白，ILDR2和LSR。这三个蛋白均定位于细胞紧密连接(TJ)处，对细胞紧密连接的形成是非常重要的。Ildr1敲除小鼠表现出严重的听力损失并伴随出生后的耳蜗毛细胞变性。在小鼠内耳中，毛细胞以及支持细胞中都可以检测到Ildr1mRNA的表达，蛋白水平上也显示ILDR1蛋白定位于细胞紧密连接(tTJs)。另一个紧密连接蛋白Tricellulin也是细胞紧密连接的结构和功能所必需。Tricellulin基因突变可导致常染色体隐性听力损伤DFNB49。ILDR1可以募集Tricellulin到细胞紧密连接处，而DFNB42相关的ILDR1突变蛋白却丧失了这个功能。　　除构成紧密连接之外，有研究表明ILDR1可以介导脂肪刺激的胆囊收缩素(CCK)分泌，提示ILDR1可能作为一个信号传导受体调节CCK的分泌过程。然而，除了调节细胞紧密连接之外，ILDR1的其他生物学功能仍然是未知的。　　可变剪接将前体mRNA的外显子以不同的排列方式拼接在一起，产生不同的成熟mRNA，最终产生结构和功能上不同的蛋白质亚型。可变剪接缺陷引起包括耳聋在内的各种类型的疾病。Transformer2protein homolog alpha(TRA2A),transformer2protein homolog beta(TRA2B)和serine/arginine-rich splicing factor1(SRSF1)都属于SR蛋白家族成员。TRA2A和TRA2B是果蝇Tra-2（最早发现的SR蛋白）在哺乳动物中的同源蛋白，而SRSF1是第一个被鉴定的哺乳动物SR蛋白，这些蛋白都被证明在可变剪接中起重要作用。在本文中，试图阐明ILDR1在调节细胞紧密连接之外的的其他功能。发现ILDR1可以结合剪接因子TRA2A，TRA2B和SRSF1，并调控下游靶基因的可变剪接。　　拟解决的科学问题：　　1)ILDR1是否具有构成细胞紧密连接之外的其它功能？　　2)ILDR1能否调控基因可变剪接？　　3)Ildr1基因敲除是否影响小鼠内耳基因的可变剪接？　　4)Angulin蛋白家族的其它成员是否也能调控基因可变剪接？研究方案及取得的研究成果　　为了回答以上科学问题，首先利用酵母双杂交筛选与ILDR1相互作用的蛋白。在得到的阳性克隆中发现了一系列剪接因子，即TRA2A，TRA2B和SRSF1。它们在结构上具有一定的相似性，都属于SR家族，具有RS结构域和RRM结构域;功能上都可以调控基因的可变剪接。紧接着利用免疫共沉淀试验验证了ILDR1同这些剪接因子的相互作用，而且发现RS结构域介导了ILDR1同TRA2A，TRA2B和SRSF1的相互作用。在COS7细胞中，过表达TRA2A，TRA2B和SRSF1后，ILDR1可被TRA2A，TRA2B和SRSF1从细胞质中拉入细胞核中，进一步验证了这种相互作用。利用RT-PCR和原位杂交技术检测了这三个剪接因子在小鼠内耳中的表达情况，发现它们在小鼠内耳的基底膜和蜗轴中均有表达，尤其是TRA2B，在螺旋神经节处有高表达。这三个基因的表达在小鼠内耳中P15至P30时达到高峰，并且呈现一定的互补模式。　　TRA2A，TRA2B和SRSF1作为剪接因子可以调控基因的可变剪接，所以接下来进行了一系列实验检验ILDR1是否通过结合这些转录因子进而调控剪接。在体外转染的细胞中发现，TRA2B（或SRSF1）可以促进TUBD1的4号外显子、IQCB1的12号外显子和Pcdh19小基因的2号外显子的可变剪接效率，而过表达ILDR1后抑制了这些基因的剪接，说明ILDR1在调控基因的可变剪接中确实发挥一定的作用。但是在动物组织水平上，却并没有发现上述基因在野生型小鼠和Ildr1基因敲除小鼠中有明显的可变剪接的变化。还收集了野生型小鼠和Ildr1基因敲除小鼠耳蜗基底膜的RNA进行RNA-seq测序，同样未发现有明显的可变剪接变化的基因。推测ILDR1作为Angulin蛋白家族成员，它的两个同源蛋白(ILDR2和LSR)有可能代偿了ILDR1的部分功能。利用RT-PCR和Q-PCR发现Ildr2在Ildr1敲除小鼠的内耳基底膜中有明显的升高趋势，而Lsr的变化并不明显。同样的原位杂交试验也验证了这种变化趋势。　　接下来检验了ILDR2能否在调控剪接方面有与ILDR1类似的作用。首先利用免疫共沉淀试验发现ILDR2和LSR都可以同TRA2A，TRA2B和SRSF1相互作用，免疫共聚焦检测荧光时发现[LDR2在TRA2A，TRA2B和SRSF1存在时可被从细胞质中拉入细胞核里，同ILDR1的结果是一致的，而LSR却仍保留在细胞质中。紧接着通过在细胞水平上过表达ILDR1//ILDR2或LSR后，发现ILDR2同ILDR1一样，抑制了基因的可变剪接效率，而LSR却并没有明显的改变基因的可变剪接效率。最后，利用siRNA在培养的HEK293T细胞中单独或共敲低内源性ILDR1和ILDR2的表达，并检测其对可变剪接效率的影响。结果显示，siRNA作用后，ILDRI以及ILDR2表达水平都有明显下降，siRNA的抑制作用都在50％以上，并且干扰效果都比较特异，相互之间没有影响。RT-PCR检测靶基因的结果表明，TUBD1和IQCB1的可变剪接效率在ILDR1或ILDR2敲低细胞中受到了改变。当siRNA同时下调ILDR1和ILDR2的表达时，TUBD1和IQCB1的可变剪接在更大程度上发生改变。该结果更进一步验证了ILDR1和ILDR2蛋白在可变剪接调节中的作用。　　创新性及意义：　　本论文以ILDR1为研究对象，对耳聋基因Ildr1在调控细胞紧密连接之外的生物学功能进行了探讨。得到的创新性研究成果及意义主要有以下两点:　　1.以Ildr1基因为研究对象，利用酵母双杂交发现ILDR1可以与TRA2A、TRA2B和SRSF1一系列剪接因子相互作用，并调控下游靶基因的可变剪接。　　2.发现Ildr1基因敲除小鼠中基因可变剪接并未受到影响，同时在敲除小鼠中Ildr2的表达量明显升高。过表达和敲低试验都表明了ILDR2在调控剪接方面同ILDR1有类似的作用。这些结果提示在Ildr1基因敲除小鼠中Ildr2可能代偿了Ildr1的功能。