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促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）是一种由肾脏产生的高度糖基化蛋白质。它在治疗肾性贫血、癌症相关性贫血（CRA）[1]、溶血性贫血、自身免疫性疾病伴发性贫血[2]等相关贫血性疾病有很好的疗效。EPO类药物在生物制药领域占有很重要的位置,因此高效地表达EPO蛋白对其有着重要意义。合适的表达载体是提高外源蛋白在哺乳动物细胞表达量的重要因素,而表达载体最重要的调控元件就是启动子。近年来延伸因子1α（EF1α）启动子以启动能力强,不受细胞周期限制等优点被人们大量应用。适合于大规模生产外源蛋白。本研究通过优化不同来源的EF1α启动子在不同物种中的启动效率,确定启动能力强的启动子序列,并利用此启动子去调控EPO蛋白的表达。研究内容分为两部分组成。第一部分是EF1α启动子效率的确定:在人、猪、仓鼠三种物种中分别得到长短不同的EF1α启动子序列。通过PCR、电转染、双荧光素酶检测等技术分析启动子的启动效率,从而得到在相应物种中的高效启动子序列。第二部分是EPO蛋白的高效表达:将得到的启动能力强的启动子Human-L和商业化的启动子Human-S分别构建带有DHFR筛选标记的EPO载体,通过Methotrexate（MTX）加压筛选得到稳定高效表达EPO蛋白的细胞株。利用ELISA、RTPCR等技术比较蛋白和mRNA的表达量。第一部分结果显示:在PK和CHO细胞中,Human-L启动子的启动效率最高;而在293T细胞中Hamster-S和Human-S启动子的启动效率更好。第二部分结果显示:Human-L较Human-S启动子驱动EPO蛋白的表达量更高。并且MTX加压浓度在100nM、200nM、500nM,与EPO的表达量呈正相关趋势。本实验筛选出了高效启动子,并构建真核表达载体,转染真核细胞。通过摸索MTX加压条件,得到高效稳定的外源蛋白表达体系,可应用于蛋白质药物真核高效表达。