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目的Wilson病(Wilson’s disease,WD),又名肝豆状核变性,是一种遗传性铜代谢障碍性疾病,铜异常沉积导致的神经炎症可加重本病的神经系统损害。中医药治疗本病具有一定的优势,多年的临床实践发现中药肝豆灵可以有效的改善WD神经系统症状,为进一步阐释其改善WD神经症状的机制,本研究基于NF-κB信号通路介导的神经炎症,以Wilson病模型TX小鼠神经炎症和铜负荷BV-2细胞模型炎性反应为研究对象,结合体内实验和体外实验,探讨中药肝豆灵改善WD的神经炎症的机制,为中医药治疗WD病提供理论支撑以及新的思路。方法第一部分(体内实验)——基于NF-κB信号通路探讨肝豆灵对Wilson病模型小鼠神经炎症调控及机制研究:研究将50只TX小鼠随机分为模型组、肝豆灵低剂量组、肝豆灵中剂量组、肝豆灵高剂量组、青霉胺组,10只野生型小鼠作为正常对照组,经过4周干预后,采用免疫荧光观测各组小鼠纹状体区Iba1、GFAP蛋白的表达;Western Blot法检测各组小鼠纹状体区域p-IκBα、p-P65、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS、caspase-3蛋白表达;RT-PCR法检测各组小鼠纹状体TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS mRNA表达。第二部分(体外实验)——基于NF-κB信号通路探讨肝豆灵对体外铜负荷BV-2细胞模型炎性反应的调控及机制研究:实验采用小胶质细胞BV-2,根据不同的干预方式分为4组:正常对照组、模型组、肝豆灵组、姜黄素组,观测铜负荷及干预24小时后,倒置显微镜观察各组细胞形态,Western Blot法检测各组p-IκBα、p-P65蛋白表达,Elisa法检测各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的表达情况;RT-PCR法检测各组TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达。结果体内实验:(1)肝豆灵对TX小鼠纹状体区域Iba1、GFAP蛋白表达的影响(免疫荧光法):与正常对照组比较,模型组纹状体区域Iba1、GFAP的表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,青霉胺、GDL中、高剂量组Iba1表达明显降低(P<0.05,P<0.01),GDL各组GFAP表达下降(P<0.01);与青霉胺组比较,GDL中、高剂量组Iba1表达降低(P<0.05),GDL高剂量组GFAP表达下降(P<0.01);与GDL低剂量组比较,GDL中、高剂量组Iba1表达下降(P<0.01),GDL高剂量组GFAP表达下降(P<0.01);与GDL中剂量组比较,GDL高剂量组GFAP表达下降(P<0.05)。(2)肝豆灵对TX小鼠纹状体区域NF-κB信号通路关键蛋白表达的影响:与正常对照组比较,模型组p-IκBα、p-P65表达量升高(P<0.01);与模型组比较,GDL各剂量组和青霉胺组p-IκBα、p-P65表达均减少(P<0.05,P<0.01);与青霉胺组比较,GDL高剂量组p-IκBα表达下降(P<0.01),GDL中、高剂量组p-P65表达下降(P<0.05,P<0.01);与GDL低剂量组比较,GDL中、高剂量组p-IκBα、p-P65表达下降(P<0.05,P<0.01);与GDL中剂量组比较,GDL高剂量组p-IκBα表达下降(P<0.01)。(3)肝豆灵对TX小鼠纹状体区域炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS表达的影响:与正常对照组比较,模型组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS表达升高(P<0.01);与模型组比较,TNF-α、IL-1β在GDL各组和青霉胺组表达均减少(P<0.05,P<0.01)。COX-2、iNOS在GDL中、高剂量组和青霉胺组表达减少(P<0.01),IL-6在GDL高剂量组表达减少(P<0.01);与青霉胺组比较,TNF-α在GDL高剂量组表达更低(P<0.05);与GDL低剂量组比较,GDL高剂量组TNF-α表达下降(P<0.01),GDL中、高剂量组IL-1β、IL-6下降无统计学意义(P>0.05);GDL中、高剂量组COX-2、iNOS下降(P<0.05,P<0.01);与GDL中剂量组比较,GDL高剂量组TNF-α表达下降(P<0.05)。(4)肝豆灵对TX小鼠纹状体区域TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS mRNA表达的影响:与正常对照组比较,模型组TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS mRNA表达较高(P<0.01);与模型组比较,TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA在GDL各组和青霉胺组表达降低(P<0.05,P<0.01),COX-2、iNOS mRNA在GDL各组表达降低(P<0.05,P<0.01);与GDL低剂量组比较,GDL中、高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 mRNA表达下降(P<0.05,P<0.01)。(5)肝豆灵对TX小鼠纹状体区域凋亡相关蛋白表达的影响:与正常对照组比较,模型组caspase-3表达升高(P<0.01);与模型组比较,GDL各组和青霉胺组caspase-3表达均减少(P<0.01);与青霉胺组比较,GDL高剂量组caspase-3表达下降(P<0.05);与GDL低剂量组比较,GDL中、高剂量组caspase-3表达下降(P<0.05)。体外实验:(1)肝豆灵对铜负荷BV-2细胞形态的影响:正常对照组BV-2细胞大部分贴壁,少部分悬浮,胞体细长,有分支状突起;模型组:小部分贴壁,大部分悬浮,部分聚集成团,细胞体积略增大,分支状突起减少、变短、变粗。肝豆灵含药血清组、姜黄素组与模型组比较,bv-2呈圆形,突起数量少而短,阿米巴样神经小胶质细胞数量减少。(2)肝豆灵对铜负荷BV-2细胞NF-κB信号通路关键蛋白的影响:与正常对照组比较,模型组p-IκBα、p-P65表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,GDL组和姜黄素剂组p-IκBα、p-P65蛋白表达均下降(P<0.01)。(3)肝豆灵对铜负荷BV-2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的影响:与正常对照组比较,模型组TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA相对表达量明显高于正常对照组(P<0.01);与模型组比较,GDL组和姜黄素组表达减少(P<0.01)。(4)肝豆灵对铜负荷BV-2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影响:与正常对照组比较,模型组TNF-α、IL-1β、IL-6分泌蛋白表达增加(P<0.01);与模型组比较,GDL组和姜黄素组表达减少(P<0.01);与姜黄素组比较,GDL组TNF-α、IL-6下降水平均低于姜黄素组(P<0.05)。结论(1)WD模型TX小鼠纹状体存在神经炎症,主要表现为小胶质细胞和星形胶质细胞存在活化现象。NF-κB信号通路表达增高,关键蛋白IκBα和P65存在磷酸化表达上调,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA和蛋白水平均高表达,纹状体脑组织细胞出现凋亡。(2)肝豆灵可以通过改善NF-κB信号通路关键蛋白IκBα和P65磷酸化,降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA和蛋白的表达,抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化,发挥抑制神经炎症的作用,减少纹状体脑组织细胞凋亡,且呈量效依赖性。(3)铜负荷BV-2细胞模型,NF-κB信号通路表达增高,关键蛋白IκBα和P65存在磷酸化表达上调,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA和蛋白水平表达升高。(4)肝豆灵药物血清可以通过减少IκBα和P65蛋白的磷酸化修饰,抑制NF-κB信号通路IκBα和P65磷酸化表达上调,降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA和蛋白水平表达。