肿瘤坏死因子受体II(Tumor necrosis factor2,TNFR2)是肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)受体蛋白大家族的主要成员，参与许多生理及病理性过程，在细胞生长、激活、生存和迁移等方面都起到了重要作用。目前，关于它的研究主要集中于淋巴细胞。新生血管发生是许多疾病的主要病理特征和严重并发症，包括眼部血管性疾病和肿瘤等。然而，目前关于TNFR2在血管内皮细胞以及血管发生发展中的生理和病理作用研究很少。因此，本研究以视网膜血管为切入点，以氧诱导视网膜病变模型为主要方法，观察了TNFR2在视网膜血管系统的发育、新生血管发生以及高氧诱发的血管退缩/生长停滞中的作用；同时，通过体外研究探索了TNFR2在内皮细胞增殖、迁移、存活和凋亡中的作用及其作用机制。　　 第一部分常氧下TNFR2对视网膜血管系统发育的影响　　 目的：探索TNFR2是否参与常氧下枧网膜血管系统的发育。　　 方法：采用TNFR2基因敲除小鼠(TNFR2-KO)、野生型小鼠(C57BL/6J，B6)和血管内皮细胞特异性高表达TNFR2(VETNFR2)转基因小鼠，于其出生后不同时间摘取眼球制作视网膜铺片和石蜡切片，并行血管染色，比较不同时期各种基因型小鼠视网膜血管的生长速度及形态特征。　　 结果：TNFR2-KO、B6和VETNFR2小鼠在视网膜血管系统发育上无显著差异。生后(Postnatal)第三天(P3)，血管从视乳头长出，位于视网膜神经纤维层，分布于视乳头至视网膜边缘的1/3～1/4范围。生后第5天(P5)，视网膜血管延伸至视乳头至视网膜边缘的1/2范围。生后第7天(P7)，视网膜血管几乎到达视网膜边缘。生后第7天开始，浅层血管逐渐向视网膜深层发展，依次生成位于外丛状层的次级血管网和位于内丛状层外侧缘的三级血管网，表层血管网逐渐由最初的多边形网络样结构转变成乔木样结构。P7，P9和P11时，三种小鼠的视网膜深层血管发育速度也相似。　　 结论：TNFR2对小鼠视网膜血管系统发育无显著影响。　　 第二部分TNFR2在氧诱导视网膜病变模型中的作用研究　　 目的：探讨TNFR2对氧诱导视网膜病变模型中细胞凋亡和新生血管形成的影响。　　 方法：采用TNFR2-KO、B6和VETNFR2乳鼠，建立氧诱导视网膜病变模型。实验组(Hyperoxia，H)于生后第7天将乳鼠随同母鼠置于含氧体积分数为75％的饲养箱中5天，然后回到正常大气环境中继续饲养5天；对照组一直置于常氧环境中饲养(Normoxia，N)。于P12(出氧箱)时行视网膜铺片和冰冻切片TUNEL染色比较视网膜中央无血管区大小及细胞凋亡情况。于P17(新生血管形成最多)时制作视网膜铺片和眼球石蜡切片，比较深层血管的恢复和视网膜前病理性新生血管的发生情况；行石蜡切片PCNA和p-P65染色检测视网膜细胞的增殖以及NF-kB通路的激活；此外，检测并比较视网膜中炎症及血管发生相关因子包括VEGFR2、TNF-α、HIF-1α、Bmx、VEGF-A、AngII、ERK和STAT3的mRNA和/或蛋白水平。　　 结果：常氧环境中饲养的各组小鼠视网膜血管形态均正常。高氧组所有小鼠造模成功，但不同基因型小鼠问存在差异。P12时，与B6小鼠相比，TNFR2-KO小鼠视网膜凋亡细胞数增多，无灌注区增大；而VETNFR2小鼠其视网膜凋亡细胞数减少，无灌注区减小。P17时，TNFR2-KO小鼠的无灌注区最大，B6小鼠和VETNFR2小鼠之间没有显著差异；TNFR2-KO小鼠的视网膜深层血管网络的恢复明显迟于B6和VETNFR2小鼠；视网膜铺片及石蜡切片结果显示B6小鼠的视网膜前新生血管形成较TNFR2-KO小鼠多，但较VETNFR2小鼠少，此结果与PCNA染色结果相一致；同时，出氧箱后相对缺氧诱发p-P65表达增高，此反应在TNFR2-KO小鼠中减弱并在VETNFR2小鼠中增强。通过RT-qPCR检测发现，相对缺氧诱导VGFR2、TNF-α、HIF-1α、Bmx、VEGF-A和AngII的mRNA水平表达增高，并且TNF-α、Bmx和AngII的增高在三种基因型小鼠中存在差异。此外，我们通过western杂交方法发现相对缺氧激发VGFR2、HIF-1α、ERK和STAT3的表达增高或活化，并且此反应在TNFR2-KO小鼠中减弱，而在VETNFR2小鼠中增强。　　 结论：TNFR2表达在氧诱导视网膜病变模型中抑制细胞凋亡，减少无血管区的形成；促进血管生长因子和炎症因子的释放和活化，从而促进细胞增殖和新生血管形成。　　 第三部TNFR2对血管内皮细胞生长和迁移作用的体外研究　　 目的：探索TNFR2在肺微血管内皮细胞的生长和迁移中的作用。　　 方法：分离、培养TNFR2-KO和B6小鼠来源的肺微血管内皮细胞(Murine LungMicrovascular Endothelial Cell，MLEC)，并进行永生化处理。使用WST-1比色法和划痕损伤试验检测并比较两种细胞的增殖能力和迁移能力。　　 结果：成功分离、培养并永生化小鼠肺微血管内皮细胞，用免疫组织化学方法鉴定细胞纯度。B6小鼠来源的内皮细胞较TNFR2-KO来源的内皮细胞增殖更快，迁移能力更强。缺氧刺激可促进两种细胞的增殖和迁移能力；TNF刺激增强B6来源细胞的增殖和迁移能力，对TNFR2-KO细胞无明显影响。　　 结论：TNFR2在体外促进微血管内皮细胞的生长和迁移。　　 第四部分TNFR2在细胞存活和凋亡中的作用及机制研究　　 目的：通过比较TNFR2野生型(TNFR2-WT)和突变型(TNFR2-59)，探索其在细胞(特别是内皮细胞)存活和凋亡中的作用及发生机制。　　 方法：使用脂质体转染或者电穿孔转染的方法使目的基因高表达，通过AnnexinV/PI染色和细胞计数判定细胞凋亡的程度，Western杂交和报告基因方法检测TNF信号通路下游各种分子的激活及细胞凋亡信号通路的激活，通过免疫荧光的方法检测目的蛋白的表达部位及其共定位，此外使用免疫沉淀的方法检测两种蛋白的结合状态。　　 结果：TNFR2-WT在细胞膜和细胞质中均有表达，对细胞的性状无影响；TNFR2-59(TNFR2的羧基端59个碱基缺失)只表达于胞质内，可引起细胞核呈病态浓缩。Anneixn V/PI染色结果显示在293T细胞中TNFR2-59过表达可引起细胞凋亡，并在TNF刺激下进一步加重；而TNFR2-WT在TNF诱导的细胞凋亡中起保护作用。Western杂交结果显示TNFR2-59激发线粒体依赖性和非依赖性细胞凋亡通路，而TNFR2-WT抑制Caspase家族介导的细胞凋亡通路。究其原因，TNFR2-WT和TNFR2-59介导不同的信号分子激活。报告基因和western杂交结果均证实TNFR2过表达可介导JNK和NF-kB通路的激活，而TNFR2-59只能激活JNK、不能激活与细胞存活相关的NF-kB。随后，我们发现TNFR2-WT和TNFR2-59在内皮细胞存活/凋亡中的作用和在293T细胞中相似。并且，两者在细胞凋亡和TNF信号通路中的作用均依赖于TNFR1。免疫荧光染色显示在内皮细胞中TNFR1和TNFR2-WT或TNFR2-59均有共定位。免疫沉淀进一步证实TNFR2-WT和TNFR2-59相互结合发挥作用，而TNFR2的胞内近膜段是其与TNFR1结合的关键部位。此外，TNFR2-59参与诱导细胞凋亡的TNFR1复合物II形成，而TNFR2-WT则激活促细胞存活的NF-kB途径，这很可能是TNFR2-WT和TNFR2-59在细胞存活/凋亡中发挥不同作用的原因。　　 结论：表达于细胞膜上的TNFR2通过激活NF-kB途径促进细胞存活；NF-kB途径被抑制时，TNFR2被内吞后参与形成TNFR1符合物II并介导细胞凋亡。