造血干细胞是形成各种血细胞之源,能分化成各类成熟血细胞,可以重建人体内的造血功能,在治疗恶性肿瘤、白血病、血液病、免疫缺陷症中发挥重要作用。但是各种来源的造血干细胞所得的数量有限,限制了临床应用。造血干细胞可以利用细胞表面标志分离获取,但难点在于造血干细胞的体外扩增。本课题组多年从事生物微胶囊的研究,已经成功地对ES细胞、胰岛素、嗜铬细胞等进行包封,并取得了显著效果,因此,我们设想利用微胶囊给造血干细胞提供一个体内模拟微环境,使其能够保持增值并不分化的状态,以达到体外扩增。因此本文以人脐血单个核细胞(MNC)为模型,在生理条件下对MNC进行微囊化包封、培养,并对微囊扩增后的造血干细胞检测其基本活性特征与增殖活性特征,主要是通过对CD34+细胞的数量及集落形成能力的考察,初步探讨微囊微环境对造血干细胞体外扩增的影响。结果:本论文结果总结如下:1、通过光镜观察及细胞计数实验确定了6×106cells/ml为最佳微囊化载量,通过石蜡切片制备及H&E染色、MTT及代谢活性的考察明确了微囊微环境能够为脐血单个核细胞提供良好的生长环境,体外维持培养18天以上,仍持续保持造血干细胞的存在;3、经过微囊扩增后的造血干细胞,通过流式细胞术及造血干细胞集落形成实验检测,可以看出造血干细胞的数量与功能都有显著提高。讨论:在体内骨髓造血微环境是决定造血干细胞增殖还是分化的关键因素。细胞的微环境是由存在骨髓中的一些基质细胞组成的,它不仅决定着对造血干细胞其支持作用,而且能够加强细胞间的紧密连接,促进造血干细胞的增殖与分化。基于本课题组多年从事微囊化细胞培养的工作基础,在生理条件下对人脐血MNC进行微囊化包封,模拟体内微环境,同时考察其基本活性特征与增殖活性的特征。实验结果证明,在微囊微环境内,造血干细胞不仅在数量上得到扩增,而且具有更强的造血功能,可以在体外维持培养15天以上,微囊可以为造血干细胞的增殖提供一个新的微环境。分析微囊的机制可能为:1、微囊内海藻酸钠凝胶所构成的培养基质及由微囊提供的限制性三维立体生长空间,可能构建了一个更类似体内的生长微环境;2、海藻酸钠是一种天然多糖,为造血干细胞增殖与基质细胞的黏附提供极其优良的平面;3、微囊膜为限制性半透膜,可阻止具有一定分子量以上的物质通过,而造血干细胞在扩增过程中外泌的细胞因子和细胞外基质被局限在微囊内或者呈现局部高浓度,这种环境类似于体内微环境,有助于造血干细胞的维持和扩增;4、海藻酸钠的粘性既可以减少细胞间的空隙,又可以促进细胞间的相互沟通。结论: APA微囊能为脐血单个核细胞提供良好的体外生长环境,使其血单个核细胞在微囊内生长,并维持其未分化状态;APA微囊能为造血干细胞的体外扩增提供特殊的微环境,扩增后的造血干细胞的数量与功能都有较大提高。