肺炎链球菌是引起肺炎、败血症、脑膜炎、鼻窦炎及中耳炎的一种常见的致病菌,是威胁人类健康最主要的病原体之一,尤其是在老人、低年龄段儿童和免疫缺陷患者这些免疫力低下的人群中更易感染。在发展中国家由于经济和卫生条件相对落后,肺炎是造成老人和儿童死亡的主要病因,而肺炎链球菌是肺炎疾病最主要的致病菌之一。据估计,全球肺炎链球菌疾病导致的五岁以下儿童的死亡约占到该年龄段儿童总死亡率的11%;仅在2000年一年,就约有一百万五岁以下儿童由于肺炎链球菌疾病而失去宝贵的生命。肺炎链球菌疾病的治疗主要是应用抗生素,随着抗生素的广泛使用和滥用出现了耐药菌株,这严重的影响了抗生素的治疗效果。疫苗的使用对于传染性疾病的控制效果更为显著,优于抗生素的使用。目前,市售的肺炎链球菌疫苗主要是23价多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗,都是基于肺炎链球菌荚膜多糖的疫苗。23价多糖疫苗能够产生非T-细胞依赖的B-细胞免疫应答,产生的针对荚膜多糖的保护性抗体可以促进免疫细胞对感染菌体的吞噬和清除。但是,非T-细胞依赖性抗原没有免疫记忆性,当机体再次遇到该抗原时不能产生二次免疫应答,只有T-细胞依赖性抗原能够引起二次免疫应答反应。肺炎链球菌多糖-蛋白结合疫苗解决了以上缺点,它将荚膜多糖共价偶联到载体蛋白表面使该疫苗免疫后具有免疫记忆性。但是该疫苗血清型覆盖面窄,而且生产工艺相当复杂,价格非常昂贵,很难在世界范围内广泛的使用。由于以上肺炎链球菌荚膜多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的缺点,研发一种血清型覆盖面广、免疫原性好和价格低廉的肺炎链球菌蛋白疫苗是当前该领域研究的热点。基于肺炎链球菌自身蛋白的新一代肺炎链球菌疫苗的研究已经有几十年的历史了,并且已经获得了很多可喜的结果。很多现在研究的肺炎链球菌疫苗候选蛋白是通过经典的研究方法被发现的,例如肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)及其他的胆固醇结合蛋白、肺炎链球菌溶血素蛋白(Ply)和肺炎链球菌表面粘附素A(PsaA)。肺炎链球菌基因组在2001年成功发表以后,更多新的肺炎链球菌疫苗候选蛋白相继被发现。大多数候选蛋白处于临床前研究,一些候选蛋白进入了临床研究,但是进入临床研究的候选蛋白大部分在临床试验中免疫原性低。因此,肺炎链球菌蛋白疫苗成功的关键是要同时具备广谱保护性和高免疫原性。本研究旨在总结前人的经验设计一种新型的肺炎链球菌蛋白疫苗并进行评价,我们不仅评价了系统免疫的候选蛋白;同时,我们也将肺炎链球菌蛋白应用到了粘膜免疫,模拟天然的感染方式以期望在肺炎链球菌感染的部位发挥更好的保护作用。我们选择了细菌样颗粒(BLP)作为粘膜免疫的佐剂,BLP不仅是一种强有力的粘膜佐剂,还是一种载体可以将抗原展示到BLP表面,粘膜免疫后不仅可以诱导出系统性免疫应答反应也可以诱导出局部粘膜免疫应答反应。本研究主要分为以下两个部分:第一部分:系统免疫(皮下免疫疫苗)一、根据文献报道,我们选取了具有保护性的两种肺炎链球菌表面蛋白作为候选抗原,即PsaA和PspA。由于PspA结构在肺炎链球菌中并不是完全保守,我们根据PspA的分型设计了两种蛋白抗原,即PsaA-PspA融合蛋白和PspA4蛋白。通过这两种蛋白联合免疫可以对95%以上的PspA分型的肺炎链球菌菌株的感染提供有效的保护。二、优化了 PsaA-PspA融合蛋白和PspA4蛋白在大肠杆菌中表达的密码子并合成目的基因;通过基因工程的方法构建了原核表达质粒,并在大肠杆菌表达系统中进行表达;通过亲和层析纯化了目的蛋白并进行鉴定。三、在小鼠体内评价了 PsaA-PspA融合蛋白和PspA4蛋白的免疫原性和免疫保护性;无论是单蛋白免疫还是联合免疫都有很好的免疫原性,通过体外全菌体Western-Blot和菌体的表面结合实验证明了免疫血清具有广谱交叉免疫反应;免疫原免疫后对不同PspA分型的肺炎链球菌攻毒小鼠都有很好的保护性。第二部分:鼻腔粘膜免疫(BLP技术疫苗)一、我们成功的将新型的粘膜免疫佐剂-细菌样颗粒(BLP)应用于肺炎链球菌蛋白疫苗,对其制备的可行性进行了评价。二、我们设计了免疫原PspA2-PA、PspA4-PA和Plym2-PA,构建了其表达质粒,并在大肠杆菌中成功的表达了 PspA2-PA、PspA4-PA和Plym2-PA蛋白;我们成功的制备了 BLP粘膜佐剂。三、制备了 PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP 和 Plym2-PA-BLP 粘膜免疫疫苗;并评价了抗原与BLP结合后的抗原性,确定了抗原与BLP结合后不影响抗原与特异性抗体的免疫反应性。四、评价了 PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP 和 Plym2-PA-BLP 粘膜免疫疫苗小鼠鼻腔免疫的免疫原性和免疫保护性;该疫苗鼻腔免疫后不仅能诱导体内系统免疫应答反应也可以诱导小鼠局部粘膜免疫应答反应;小鼠鼻腔免疫后对不同PspA分型的肺炎链球菌的致死性攻毒都能够提供有效的保护作用。综上所述,本研究成功的设计、制备和评价了两种肺炎链球菌蛋白疫苗,即皮下免疫疫苗PsaA-PspA与PspA4和粘膜免疫疫苗BLP技术疫苗。两种疫苗都有很好的免疫原性,免疫后对不同PspA分型的肺炎链球菌攻毒小鼠都有很好的保护作用,对很多菌株的攻毒小鼠的保护性都能达到100%的保护率,保护作用优于23价肺炎多糖疫苗对照组。因此,这两种肺炎链球菌蛋白疫苗都是很有希望能够成为新一代的肺炎链球菌疫苗。本论文的创新点:在本研究中,我们首次将PspA蛋白与PsaA蛋白构建成了一种新型的融合蛋白PsaA-PspA,通过和PspA4蛋白联合免疫增加特异性抗体与肺炎链球菌的广谱交叉免疫反应,并通过动物模型评价了蛋白疫苗的免疫保护性;本研究首次将BLP技术应用到了肺炎链球菌PspA和Ply蛋白上,评价了粘膜免疫后系统免疫应答反应和局部粘膜免疫应答反应,并通过动物模型评价了疫苗的免疫保护性。