背景和目的肠上皮屏障可以阻止肠腔内的抗原物质,如细菌和内毒素等进入血液循环。紧密连接(TJ)在细胞的周围顶端形成连续的环状结构,封闭相邻细胞的间隙,是上皮屏障最重要的组成部分,也是维持肠道的屏障功能所必须的。紧密连接破坏导致肠道通透性升高,细菌产物从肠腔进入循环,造成系统性炎症反应(SIRS)和多器官功能不全(MODS)甚至衰竭3。中暑是一种严重的疾病状态,其特点是核心体温升高超过40℃、中枢神经系统损害并伴有黏膜结构和功能破坏4。大鼠中暑模型、Caco-2和T84细胞的热打击模型发现,肠屏障功能在中暑的病理进程中起重要作用,热打击可增加肠道通透性、降低上皮细胞跨膜电阻(TEER),从而削弱肠屏障的完整性。对动物进行热打击后观察到,内毒素或脂多糖(LPS)从肠腔经过肠上皮进入循环的通过率增加。相反,抗-LPS抗体可保护机体,防止从热损伤状态向中暑的病理过程转化。 因此,保护肠道屏障功能完整是预防中暑的一个重要方面。n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)包括二十碳五烯酸(EPA,20：5)和二十二碳六烯酸(DHA,22：6),既往的研究发现,添加n-3 PUFAs可有效对抗炎症因子导致的肠上皮细胞通透性增加,包括紧密连接结构的破坏、TEER下降和对大分子荧光物质FITC-dextran (FD4)的滤过增加等肠上皮功能不全情况。此外,n-3 PUFAs可下调促炎症因子信号的产生和保护肠屏障,因而对类风湿关节炎、炎症性肠病和银屑病等免疫调节紊乱的疾病有益。有证据显示,EPA上调紧密连接蛋白occludin的表达,但花生四烯酸(AA, n-6 PUFA)则下调其表达。而且,动物研究也显示,n-3 PUFAs能降低从肠腔移位到系统循环的内毒素量。尽管有这些发现,n-3 PUFAs对热打击后肠道上皮TJ的功能是否有影响仍然不清楚,机制也未被研究。因此,我们假设,热打击前添加n-3PUFAs可以逆转肠上皮通透性的升高和紧密连接蛋白的改变,保护肠道屏障功能和降低血浆内毒素水平,进而达到保护器官功能、预防中暑发生和进展的目的。本研究中,我们使用人肠上皮Caco-2单层细胞作为肠上皮屏障紧密连接的模型,观察热打击后的改变；以及使用大鼠制备中暑模型,研究热打击对肠上皮屏障的影响。以此确定n-3 PUFAs酸是否对破坏的肠上皮紧密连接功能具有保护作用。本研究有以下目的：1、以Caco-2细胞为肠上皮屏障的体外模型,研究热打击对肠上皮紧密连接功能的影响；2、研究不同浓度EPA对热打击后肠黏膜屏障的作用,确定后续实验的最佳使用剂量；3、研究EPA对热打击后肠屏障上皮细胞间紧密连接的影响,以及作为对照的DHA和AA的作用。详细阐明EPA对紧密连接结构的完整性、以及紧密连接蛋白的表达及分布变化的影响,从而造成的上皮屏障功能变化。4、建立中暑大鼠模型,观察中暑大鼠肠上皮紧密连接结构的破坏情况；观察和检测EPA预处理后的大鼠紧密连接结构和功能的变化,测定血液中肠黏膜的通透性指标,证实EPA对发生中暑大鼠的肠上皮屏障的紧密连接具有保护作用。材料和方法主要材料肠上皮细胞株Caco-2细胞(ATCC, Manassas, VA),多不饱和脂肪酸和辣根过氧化物酶(Sigma),小鼠抗occludin抗体(BD Biosciences)、兔抗ZO-1抗体(Invitrogen)。Transwell小室(Corning公司)。Trizol及逆转录试剂盒(TAKARA)、聚合酶链反应试剂盒(Roche)、 CCK-8试剂盒(碧云天)、内毒素试剂盒(CAMBREX)、D-乳酸试剂盒(Biovision)。方法1.热打击对单层肠上皮Caco-2细胞屏障功能的影响采用人肠上皮细胞株Caco-2建立肠屏障模型,经37～43℃持续1h的热打击后,检测单层肠上皮细胞的完整性和通透性,指标包括transwell小室内的细胞单层跨膜电阻抗(TEER)值和对大分子物质辣根过氧化物酶(HRP)的通透性；采用实时定量PCR(QRT-PCR)法测定紧密连接蛋白occludin和ZO-1的mRNA表达水平,Western blotting检测它们的蛋白表达水平。2.二十碳五烯酸影响热打击后肠上皮细胞紧密连接的剂量-效应关系使用人Caco-2细胞株建立肠上皮细胞紧密连接模型,分别加入25、50、100、150μM的EPA培养96h后,进行43℃的热打击。分别使用CCK-8法检测细胞增殖,transwell小室内测定单层跨膜电阻抗(TEER)值和对大分子物质辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,Western blotting检测occludin蛋白的表达水平,显微镜下观察考马斯亮蓝染色细胞骨架的变化。3.二十碳五烯酸对热打击破坏的肠上皮紧密连接的保护作用人肠上皮细胞株Caco-2使用50 μM的EPA, DHA或AA预先孵育96h,进行43℃持续1h的热打击。电阻仪测定测定单层跨膜电阻抗(TEER)值,酶标仪测定对大分子物质辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,采用QRT-PCR测定紧密连接蛋白occludin和ZO-1的mRNA表达水平,Western blotting检测蛋白表达水平,免疫荧光观察紧密连接蛋白分布,透射电镜观察紧密连接的超微结构。4.二十碳五烯酸对中暑大鼠肠上皮紧密连接的作用雄性SD大鼠30只,随机分为5组：正常对照组(0.9%生理盐水1ml/kg)、中暑对照组(0.9%生理盐水1ml/kg)、EPA预灌胃组(1g/kg)、DHA预灌胃组(1g/kg)和玉米油预灌胃组(1g/kg)。对后4组进行温度为37℃、湿度为60%的高温处理,制备中暑动物模型。然后,分别测定门静脉和腹主动脉的血浆内毒素水平,腹主动脉血浆的D-乳酸含量,以及离体回肠对HRP的通过率；取回盲部附近的部分回肠及结肠,行常规病理检查和免疫荧光观察TJ蛋白occludin和ZO-1的分布；透射电镜观察肠上皮细胞的紧密连接超微结构；刮取肠黏膜使用Western blotting检测其中的TJ蛋白表达。统计学处理所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示,数据分析采用SPSS13.0分析软件进行。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)作多重比较。配对计量资料的比较采用配对t检验。P<0.05设定为差异有显著性。结果1温度升高对单层肠上皮细胞屏障功能的影响热打击时温度升高明显降低TEER值,漏入下室中的大分子物质HRP逐渐增加,与37℃组相比,两者在39℃、41℃和43℃组均有显著性差异(P<0.01)。温度从37℃升高到41℃,紧密连接蛋白occludin的mRNA表达和蛋白表达逐渐增加,而当温度继续上升到43℃,其表达反而下降。随温度升高,ZO-1的mRNA表达和蛋白表达呈现下降趋势。43℃热打击从1h增加至4h,occludin和ZO-1的蛋白表达逐渐下降。2不同浓度的EPA对热打击后肠上皮细胞屏障的影响EPA的浓度在0-100μM的范围内,都有促进细胞增殖的作用,其中,50μM的EPA促进增殖的效果最强(与其他浓度相比,P<0.01)。不同浓度的EPA处理24 h-96h,随时间的延长,各组的TEER值增高,50μ M的EPA处理后效果最明显,如浓度继续增高,则效应下降。EPA在0-100μM的范围内,均可明显降低对HRP的通透性,EPA为50μM组通透性升高的幅度最小。50 μ M的EPA对occludin的表达增加最明显,对维持细胞骨架的正常结构有利。因此,选择50 u M作为EPA的有效剂量较为合理。3多不饱和脂肪酸对热打击后肠上皮细胞紧密连接的影响多不饱和脂肪酸孵育96h并进行43℃C持续1h的热打击后,虽然各组的TEER值都下降,但EPA组的值仍然最高(与43℃C组对照组相比,P<0.01)。热打击可以明显升高细胞单层对HRP的通过率,但经过EPA预先孵育的细胞升高的程度明显降低(P<0.01)。而DHA组和AA组的TEER值和HRP的通过率与对照组相比没有显著性差异。‘Western blot和QRT-PCR的检测结果分别显示,,EPA预处理可明显增加TJ蛋白occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表达(P<0.01),DHA可使两者轻度增加,但AA变化不大。免疫荧光发现,热打击后,TJ蛋白occludin、ZO-1在膜上的表达密度降低,且分布不连续；EPA预孵育的细胞能够维持其分布的完整性,抑制热打击造成的表达下降,DHA的维持作用稍差,而AA无明显作用。透射电镜下观察TJ超微结构发现,热打击后,相邻细胞间的紧密连接变短、疏松,结构不完整、呈“开放状态”；EPA预处理组细胞间的紧密连接超微结构较完整、密度下降不明显、长度变化不大。而DHA组的细胞紧密连接不连续,但密度较43℃C热打击组稍高；AA组只轻微减轻紧密连接长度的改变。4二十碳五烯酸对中暑大鼠肠上皮紧密连接具有保护作用中暑后肠道通透性指标发生变化。门静脉和腹主动脉血液的内毒素水平结果均显示,中暑后各组大鼠内毒素水平都明显升高(与正常对照组相比,P<0.01),EPA和DHA处理组均显著低于中暑对照组(P<0.01),但EPA组的数值与正常对照组更为接近,玉米油组与中暑对照组没有明显差异。D乳酸含量的结果显示：中暑对照组的D乳酸浓度明显升高；与中暑对照组相比,EPA和DHA预处理都使其降低,而玉米油无明显作用。离体肠对腔内大分子物质HRP的通透性显示,中暑后通透性显著升高,EPA和DHA预灌胃可明显减弱其升高程度(P<0.01),玉米油组与中暑对照组差别不大。病理结构的变化：中暑后肠黏膜绒毛结构紊乱、上皮细胞脱落；EPA组的黏膜组织仅见充血及轻度水肿,上皮细胞排列整齐、脱落较少,绒毛结构较完整；DHA组有较明显的细胞脱落现象；玉米油组可见较多上皮细胞脱落。超微结构发生改变：中暑后紧密连接分开、呈“开放状态”,有的部分断裂,连接疏松,细胞膜表面的微绒毛断裂；EPA组细胞间的紧密连接较完整、密度下降不明显、长度变化不大；DHA组的结构也较完整、但长度缩短；玉米油组改善不明显。TJ蛋白occludin和ZO-1的表达：荧光显示,中暑后的蛋白表达明显下降,分布不连续,甚至大量缺失；EPA组和DHA组表达较好,紧密连接蛋白分布较连续、致密；玉米油组的表达也下降,可见明显的脱落现象。Western blot结果显示,中暑后紧密连接蛋白的表达下降,EPA和DHA都可以增加蛋白的表达,EPA的增强作用更为明显,玉米油与中暑组无明显差别。结论1热打击可明显造成肠上皮细胞间紧密连接的损伤,从而破坏肠屏障功能；2一定剂量范围内的EPA能够保护肠上皮紧密连接,对肠黏膜屏障有一定的保护作用。与其他浓度组相比,浓度为50μM的EPA效果最为明显；3 EPA对热打击造成的肠上皮紧密连接损伤和屏障功能破坏具有保护作用,而DHA的保护作用稍差,AA没有观察到明显作用；4 EPA预防性应用能够改善中暑大鼠肠上皮紧密连接的损伤,减轻内毒素血症,这种保护作用可能与EPA对肠黏膜紧密连接蛋白occludin和ZO-1的上调有关。DHA也有一定的保护作用,但较EPA差。玉米油没有明显作用。