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目的：
中药鹤蟾片是周岱翰教授研究创制的国内第一个治疗原发性支气管肺癌及肺部转移癌的复方中成药，有解毒除痰、凉血祛瘀、消癥散结之效。近年来大量前期研究表明鹤蟾片具有很好的临床疗效，但由于中药复方化学成分的复杂性，使得在揭示其作用机理上存在很多困难，限制了临床推广应用。沙蟾毒精是鹤蟾片消瘤散结主药干蟾皮的抗癌活性成分，本课题通过建立肺癌裸鼠移植瘤模型，观察鹤蟾片及沙蟾毒精的在体抑瘤效果，并进一步应用蛋白质芯片技术筛选沙蟾毒精发挥抑制肺癌侵袭转移作用可能分子机制，再通过体外实验探讨沙蟾毒精对肺癌A549、H1299细胞株侵袭和迁移的影响，明确鹤蟾片及沙蟾毒精发挥抗肺癌转移的作用靶点，最后收集病人临床组织样本进行靶点验证，为揭示鹤蟾片及沙蟾毒精抑制肺癌转移的分子机制，以及肺癌转移病人的临床治疗，提供新的思路和科学依据。
方法：
1.建立肺癌裸鼠皮下移植瘤模型，待肿瘤体积达到100-200mm3时，将荷瘤小鼠随机分为5组，每组10只，分别给予对照组生理盐水灌胃，阳性药组(顺铂2mg/kg)顺铂腹腔注射，鹤蟾片低剂量组(1.37g/kg)、鹤蟾片中剂量组(2.74g/kg)、鹤蟾片高剂量组(5.48g/kg)给予相应中药灌胃，一天一次，连续给药21天。记录并统计裸鼠体重、瘤体积；实验结束最后一天，麻醉处死裸鼠后，剥离肿瘤并测量瘤量；摘取肝肾，分别称量实验动物的肝、肾的重量；HE染色观察鹤蟾片对小鼠肝肾形态学改变的影响。
2.沙蟾毒精在体抑瘤实验，造模方法同前，分为对照组、阳性药组(顺铂2mg/kg)、沙蟾毒精低剂量组(3mg/kg)、沙蟾毒精高剂量组(6mg/kg)。沙蟾毒精治疗组给予药物腹腔注射，对照组给予同体积生理盐水腹腔注射，阳性药组给予顺铂腹腔注射，一天一次，连续给药18天。记录并统计裸鼠体重、瘤体积；肿瘤组织切片Tunel染色检测沙蟾毒精对肺癌移植瘤组织的凋亡情况；采用蛋白质芯片筛选沙蟾毒精抑制肺癌侵袭和转移的分子机制，并对差异表达蛋白进行热图、火山图、GO及KEGG信号通路富集；采用蛋白免疫印迹法检测移植瘤组织中GPNMB、MMP-2蛋白表达水平，验证蛋白质芯片结果；采用蛋白免疫印迹法检测转移信号通路Raf/Erk相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2的表达，检测转移相关蛋白MMP-9表达。
3.采用CCK-8法检测沙蟾毒精对人肺腺癌细胞株A549、H1299细胞增殖的影响，以确定后续细胞实验给药时间及剂量；采用细胞划痕及transwell实验检测沙蟾毒精对人肺腺癌细胞株A549、H1299细胞侵袭和迁移能力的影响；采用蛋白免疫印迹法检测沙蟾毒精对人肺腺癌A549、H1299细胞株中GPNMB、MMP-2蛋白表达的影响；采用实时荧光定量PCR检测沙蟾毒精对人肺腺癌A549、H1299细胞株中GPNMBmRNA、MMP-2mRNA表达的影响；采用蛋白免疫印迹法检测沙蟾毒精对转移信号通路Raf/Erk相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2表达的影响。
4.分别采用过表达GPNMB蛋白质粒转染A549、H1299细胞以及Raf/Erk信号通路激动剂Honokiol处理A549、H1299细胞，蛋白免疫印迹法检测A549、H1299细胞株中GPNMB、MMP-2蛋白的表达变化、Raf/Erk信号通路相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2的表达变化；transwell实验检测过表达GPNMB蛋白质粒转染以及Raf/Erk信号通路激动剂Honokiol处理后，A549、H1299细胞侵袭能力的变化，以此来确定GPNMB蛋白与Raf/Erk信号通路以及MMP-2蛋白的上下游关系。
5.采用蛋白免疫印迹法检测鹤蟾片干预裸鼠后移植瘤组织中GPNMB、MMP-2以及转移信号通路Raf/Erk相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2的表达。
6.采用免疫组化检测99例非小细胞肺癌病人肺癌组织中GPNMB蛋白表达情况；体外实验检测A549、H1299、PC-9三种人肺癌细胞及正常人肺上皮Beas-2B细胞中GPNMB蛋白的表达，以明确GPNMB蛋白是否为非小细胞肺癌病人转移的干预靶点。
结果：
1.鹤蟾片在体实验结果显示，与对照组相比，阳性组及鹤蟾片低、中、高剂量组裸鼠移植瘤体积均有显著减小(P＜0.05)；与对照组相比，阳性组裸鼠体重有显著性降低(P=0.001＜0.05)，鹤蟾片低、中、高剂量组裸鼠体重无显著性差异(P＞0.05)；与对照组相比，阳性组及鹤蟾片低、中、高剂量组裸鼠移植瘤重量显著减小(P＜0.05)；与正常裸鼠比较，所有组别肝脏指数均无显著性差异(P＞0.05)；与正常组相比，所有组别肾脏指数均无显著性差异(P＞0.05)。肝肾内脏组织病理变化方面，各组别肝脏切片肝小叶结构清晰，肝细胞无肿大，胞核居中，细胞间界限清晰，各组切片组织形态无明显差别。各组病理切片未见明显肾小球萎缩、纤维化，肾小管萎缩、变性、消失，纤维组织增生，肾小球无代偿肥大，肾小管无扩张。
2.沙蟾毒精在体实验结果显示，与对照组相比，阳性组及沙蟾毒精低、高剂量组裸鼠移植瘤体积均有显著性减小(P＜0.05)，与阳性组相比，沙蟾毒精高剂量组裸鼠移植瘤体积减小更显著(P＜0.05)；与对照组相比，阳性组裸鼠移植瘤重量无显著性差异(P=0.242＞0.05)，而沙蟾毒精低剂量组裸鼠移植瘤重量显著减小(P=0.000＜0.05)，沙蟾毒精高剂量组裸鼠移植瘤重量显著减小(P=0.000＜0.05)；裸鼠移植瘤组织TUNEL染色结果显示，与对照组比较，沙蟾毒精低、高剂量组裸鼠移植瘤组织凋亡细胞显著增多。
3.蛋白质芯片共筛选到两个与肺癌转移有关的显著性差异表达蛋白，分别为GPNMB、MMP-2蛋白，GO及KEGG信号通路数据库富集分析结果显示，调节细胞粘附的蛋白得到较多富集，数量和P值均有统计学差异。验证蛋白质芯片结果，与对照组相比，沙蟾毒精低、高剂量组GPNMB表达水平均显著下调(P＜0.05)；与对照组相比，阳性组及沙蟾毒精低、高剂量组MMP-2表达水平均显著下调(P＜0.05)。
4.分别将A549、H1299两种细胞持续培养，每隔12h使用酶标仪检测其OD值。结果可见，A549细胞密度为5×104/ml时，对数期较长；H1299细胞密度为5×104/ml时，对数期较长。通过多次浓度筛选，最终选择0、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM的浓度梯度进行时间剂量依赖测试，结果表明，A549、H1299细胞经过上述不同剂量浓度梯度的沙蟾毒精处理12h、24h、48h后，与对照组比较，相同时间点，随浓度增加，细胞存活数量显著下降(P＜0.05)；在同一浓度处，随时间点延长，细胞存活数量显著下降(P＜0.05)。沙蟾毒精作用A549及H1299细胞24h的IC50分别为20.55nM、21.13nM。利用200μl枪头制造细胞划痕，分别给予A549、H1299细胞浓度为0、10nM、20nM、40nM的沙蟾毒精处理后，0h时，A549细胞各组的划痕面积比较，无显著性差异(F=1.278，P=0.346＞0.05)，H1299细胞各组的划痕面积比较，无显著性差异(F=0.872，P=0.495＞0.05)；12h、24h、36h时,与对照组相比，10nM、20nM、40nM组划痕面积均显著性增加(P＜0.05)。观察各组穿过transwell小室的细胞数量，与对照组相比，10nM、20nM、40nM组侵袭细胞数量均有显著性减少(P＜0.05)。
5.分别用0、10nM、20nM、40nM的沙蟾毒精处理A549及H1299细胞24h，经western-blot检测，与对照组相比，沙蟾毒精组GPNMB蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)，沙蟾毒精组GPNMBmRNA表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精组MMP-2蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)，沙蟾毒精组MMP-2mRNA表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精组P-c-raf蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精组P-erk1/2蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)。
6.过表达GPNMB质粒转染A549、H1299细胞后，经western-blot检测，与pReceiver-M02-AC组相比，pReceiver-M02-GPNMB组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)；与对照组相比，pReceiver-M02-GPNMB组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)，而pReceiver-M02-GPNMB+ARE组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)。Transwell实验发现与pReceiver-M02-AC组相比，pReceiver-M02-GPNMB组侵袭细胞数量有显著性增加(P＜0.05)；与对照组相比，pReceiver-M02-GPNMB组侵袭细胞数量有显著性增加(P＜0.05)，而pReceiver-M02-GPNMB+ARE组侵袭细胞数量有显著性减少(P＜0.05)。
7.Raf/Erk信号通路激动剂Honokiol处理A549、H1299细胞后，经western-blot检测，与对照组相比，Honokiol组GPNMB蛋白表达水平无显著性差异(P＞0.05)，MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)；与Honokiol组对比，Honokiol+ARE组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)。Transwell实验发现，与对照组相比，Honokiol组侵袭细胞数量显著增加(P＜0.05)；与Honokiol组相比，Honokiol+ARE组侵袭细胞数量显著减少(P＜0.05)。
8.取沙蟾毒精在体实验各组裸鼠移植瘤组织，经western-blot检测，与对照组相比，阳性组MMP-9蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)，P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平无显著性差异(P＞0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精低、高剂量组MMP-9蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)。取鹤蟾片在体实验各组裸鼠移植瘤组织，经western-blot检测，与对照组相比，阳性组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平无显著差异(P＞0.05)；与对照组相比，鹤蟾片组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)，且随着给药浓度的增加，下调作用增强。
9.99例非小细胞肺癌患者中，男性67例，女性32例；患者年龄最大84岁，最小32岁，平均年龄56.11±9.85岁；99例患者中有吸烟史的60例；发病部位，左肺26例，右肺73例；病例类型肺腺癌52例，肺鳞癌47例；发生转移的47例(部位包括肝、肺、骨、脑、肾上腺、淋巴结等)，未发生转移的52例。结果显示，与非转移组相比，转移组GPNMB蛋白表达量有显著性增加(t=3.596，P=0.001＜0.05)；经western-blot检测正常人肺上皮细胞及不同类型肺癌细胞中GPNMB蛋白表达情况，与正常人肺上皮Beas-2B细胞对比，A549组、H1299组、PC-9组GPNMB蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)。
结论：
1.鹤蟾片可以抑制肺癌A549移植瘤的体积及瘤重，且对小鼠肝肾功能无明显影响；沙蟾毒精可以抑制肺癌A549移植瘤的体积及瘤重，促进移植瘤组织细胞凋亡。
2.沙蟾毒精以浓度和时间依赖性抑制A549细胞、H1299细胞的增殖；以浓度和时间依赖性抑制A549、H1299细胞的迁移和侵袭。
3.沙蟾毒精以浓度依赖性下调GPNMB、MMP-2蛋白表达，以浓度依赖性下调信号通路蛋白P-c-raf、P-erk1/2蛋白表达，沙蟾毒精能逆转过表达GPNMB后引起的P-c-raf、P-erk1/2、MMP-2等蛋白的上调，因此考虑GPNMB为P-c-raf、P-erk1/2、MMP-2等蛋白的上游蛋白。同样，沙蟾毒精能逆转激活P-c-raf、P-erk1/2引起的MMP-2的上调，表明沙蟾毒精是通过GPNMB/Raf/Erk信号通路发挥抑制非小细胞肺癌的侵袭和转移的作用。
4.鹤蟾片通过GPNMB/Raf/Erk信号通路来发挥抑制肺癌侵袭和转移的作用。
5.GPNMB蛋白是非小细胞肺癌转移病人的干预靶点，值得进一步研究和推广。
中药鹤蟾片是周岱翰教授研究创制的国内第一个治疗原发性支气管肺癌及肺部转移癌的复方中成药，有解毒除痰、凉血祛瘀、消癥散结之效。近年来大量前期研究表明鹤蟾片具有很好的临床疗效，但由于中药复方化学成分的复杂性，使得在揭示其作用机理上存在很多困难，限制了临床推广应用。沙蟾毒精是鹤蟾片消瘤散结主药干蟾皮的抗癌活性成分，本课题通过建立肺癌裸鼠移植瘤模型，观察鹤蟾片及沙蟾毒精的在体抑瘤效果，并进一步应用蛋白质芯片技术筛选沙蟾毒精发挥抑制肺癌侵袭转移作用可能分子机制，再通过体外实验探讨沙蟾毒精对肺癌A549、H1299细胞株侵袭和迁移的影响，明确鹤蟾片及沙蟾毒精发挥抗肺癌转移的作用靶点，最后收集病人临床组织样本进行靶点验证，为揭示鹤蟾片及沙蟾毒精抑制肺癌转移的分子机制，以及肺癌转移病人的临床治疗，提供新的思路和科学依据。
方法：
1.建立肺癌裸鼠皮下移植瘤模型，待肿瘤体积达到100-200mm3时，将荷瘤小鼠随机分为5组，每组10只，分别给予对照组生理盐水灌胃，阳性药组(顺铂2mg/kg)顺铂腹腔注射，鹤蟾片低剂量组(1.37g/kg)、鹤蟾片中剂量组(2.74g/kg)、鹤蟾片高剂量组(5.48g/kg)给予相应中药灌胃，一天一次，连续给药21天。记录并统计裸鼠体重、瘤体积；实验结束最后一天，麻醉处死裸鼠后，剥离肿瘤并测量瘤量；摘取肝肾，分别称量实验动物的肝、肾的重量；HE染色观察鹤蟾片对小鼠肝肾形态学改变的影响。
2.沙蟾毒精在体抑瘤实验，造模方法同前，分为对照组、阳性药组(顺铂2mg/kg)、沙蟾毒精低剂量组(3mg/kg)、沙蟾毒精高剂量组(6mg/kg)。沙蟾毒精治疗组给予药物腹腔注射，对照组给予同体积生理盐水腹腔注射，阳性药组给予顺铂腹腔注射，一天一次，连续给药18天。记录并统计裸鼠体重、瘤体积；肿瘤组织切片Tunel染色检测沙蟾毒精对肺癌移植瘤组织的凋亡情况；采用蛋白质芯片筛选沙蟾毒精抑制肺癌侵袭和转移的分子机制，并对差异表达蛋白进行热图、火山图、GO及KEGG信号通路富集；采用蛋白免疫印迹法检测移植瘤组织中GPNMB、MMP-2蛋白表达水平，验证蛋白质芯片结果；采用蛋白免疫印迹法检测转移信号通路Raf/Erk相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2的表达，检测转移相关蛋白MMP-9表达。
3.采用CCK-8法检测沙蟾毒精对人肺腺癌细胞株A549、H1299细胞增殖的影响，以确定后续细胞实验给药时间及剂量；采用细胞划痕及transwell实验检测沙蟾毒精对人肺腺癌细胞株A549、H1299细胞侵袭和迁移能力的影响；采用蛋白免疫印迹法检测沙蟾毒精对人肺腺癌A549、H1299细胞株中GPNMB、MMP-2蛋白表达的影响；采用实时荧光定量PCR检测沙蟾毒精对人肺腺癌A549、H1299细胞株中GPNMBmRNA、MMP-2mRNA表达的影响；采用蛋白免疫印迹法检测沙蟾毒精对转移信号通路Raf/Erk相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2表达的影响。
4.分别采用过表达GPNMB蛋白质粒转染A549、H1299细胞以及Raf/Erk信号通路激动剂Honokiol处理A549、H1299细胞，蛋白免疫印迹法检测A549、H1299细胞株中GPNMB、MMP-2蛋白的表达变化、Raf/Erk信号通路相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2的表达变化；transwell实验检测过表达GPNMB蛋白质粒转染以及Raf/Erk信号通路激动剂Honokiol处理后，A549、H1299细胞侵袭能力的变化，以此来确定GPNMB蛋白与Raf/Erk信号通路以及MMP-2蛋白的上下游关系。
5.采用蛋白免疫印迹法检测鹤蟾片干预裸鼠后移植瘤组织中GPNMB、MMP-2以及转移信号通路Raf/Erk相关蛋白c-raf、P-c-raf、erk1/2、P-erk1/2的表达。
6.采用免疫组化检测99例非小细胞肺癌病人肺癌组织中GPNMB蛋白表达情况；体外实验检测A549、H1299、PC-9三种人肺癌细胞及正常人肺上皮Beas-2B细胞中GPNMB蛋白的表达，以明确GPNMB蛋白是否为非小细胞肺癌病人转移的干预靶点。
结果：
1.鹤蟾片在体实验结果显示，与对照组相比，阳性组及鹤蟾片低、中、高剂量组裸鼠移植瘤体积均有显著减小(P＜0.05)；与对照组相比，阳性组裸鼠体重有显著性降低(P=0.001＜0.05)，鹤蟾片低、中、高剂量组裸鼠体重无显著性差异(P＞0.05)；与对照组相比，阳性组及鹤蟾片低、中、高剂量组裸鼠移植瘤重量显著减小(P＜0.05)；与正常裸鼠比较，所有组别肝脏指数均无显著性差异(P＞0.05)；与正常组相比，所有组别肾脏指数均无显著性差异(P＞0.05)。肝肾内脏组织病理变化方面，各组别肝脏切片肝小叶结构清晰，肝细胞无肿大，胞核居中，细胞间界限清晰，各组切片组织形态无明显差别。各组病理切片未见明显肾小球萎缩、纤维化，肾小管萎缩、变性、消失，纤维组织增生，肾小球无代偿肥大，肾小管无扩张。
2.沙蟾毒精在体实验结果显示，与对照组相比，阳性组及沙蟾毒精低、高剂量组裸鼠移植瘤体积均有显著性减小(P＜0.05)，与阳性组相比，沙蟾毒精高剂量组裸鼠移植瘤体积减小更显著(P＜0.05)；与对照组相比，阳性组裸鼠移植瘤重量无显著性差异(P=0.242＞0.05)，而沙蟾毒精低剂量组裸鼠移植瘤重量显著减小(P=0.000＜0.05)，沙蟾毒精高剂量组裸鼠移植瘤重量显著减小(P=0.000＜0.05)；裸鼠移植瘤组织TUNEL染色结果显示，与对照组比较，沙蟾毒精低、高剂量组裸鼠移植瘤组织凋亡细胞显著增多。
3.蛋白质芯片共筛选到两个与肺癌转移有关的显著性差异表达蛋白，分别为GPNMB、MMP-2蛋白，GO及KEGG信号通路数据库富集分析结果显示，调节细胞粘附的蛋白得到较多富集，数量和P值均有统计学差异。验证蛋白质芯片结果，与对照组相比，沙蟾毒精低、高剂量组GPNMB表达水平均显著下调(P＜0.05)；与对照组相比，阳性组及沙蟾毒精低、高剂量组MMP-2表达水平均显著下调(P＜0.05)。
4.分别将A549、H1299两种细胞持续培养，每隔12h使用酶标仪检测其OD值。结果可见，A549细胞密度为5×104/ml时，对数期较长；H1299细胞密度为5×104/ml时，对数期较长。通过多次浓度筛选，最终选择0、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM的浓度梯度进行时间剂量依赖测试，结果表明，A549、H1299细胞经过上述不同剂量浓度梯度的沙蟾毒精处理12h、24h、48h后，与对照组比较，相同时间点，随浓度增加，细胞存活数量显著下降(P＜0.05)；在同一浓度处，随时间点延长，细胞存活数量显著下降(P＜0.05)。沙蟾毒精作用A549及H1299细胞24h的IC50分别为20.55nM、21.13nM。利用200μl枪头制造细胞划痕，分别给予A549、H1299细胞浓度为0、10nM、20nM、40nM的沙蟾毒精处理后，0h时，A549细胞各组的划痕面积比较，无显著性差异(F=1.278，P=0.346＞0.05)，H1299细胞各组的划痕面积比较，无显著性差异(F=0.872，P=0.495＞0.05)；12h、24h、36h时,与对照组相比，10nM、20nM、40nM组划痕面积均显著性增加(P＜0.05)。观察各组穿过transwell小室的细胞数量，与对照组相比，10nM、20nM、40nM组侵袭细胞数量均有显著性减少(P＜0.05)。
5.分别用0、10nM、20nM、40nM的沙蟾毒精处理A549及H1299细胞24h，经western-blot检测，与对照组相比，沙蟾毒精组GPNMB蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)，沙蟾毒精组GPNMBmRNA表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精组MMP-2蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)，沙蟾毒精组MMP-2mRNA表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精组P-c-raf蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精组P-erk1/2蛋白表达水平显著下调，且随着给药浓度的增加，下调作用增强(P＜0.05)。
6.过表达GPNMB质粒转染A549、H1299细胞后，经western-blot检测，与pReceiver-M02-AC组相比，pReceiver-M02-GPNMB组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)；与对照组相比，pReceiver-M02-GPNMB组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)，而pReceiver-M02-GPNMB+ARE组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)。Transwell实验发现与pReceiver-M02-AC组相比，pReceiver-M02-GPNMB组侵袭细胞数量有显著性增加(P＜0.05)；与对照组相比，pReceiver-M02-GPNMB组侵袭细胞数量有显著性增加(P＜0.05)，而pReceiver-M02-GPNMB+ARE组侵袭细胞数量有显著性减少(P＜0.05)。
7.Raf/Erk信号通路激动剂Honokiol处理A549、H1299细胞后，经western-blot检测，与对照组相比，Honokiol组GPNMB蛋白表达水平无显著性差异(P＞0.05)，MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)；与Honokiol组对比，Honokiol+ARE组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)。Transwell实验发现，与对照组相比，Honokiol组侵袭细胞数量显著增加(P＜0.05)；与Honokiol组相比，Honokiol+ARE组侵袭细胞数量显著减少(P＜0.05)。
8.取沙蟾毒精在体实验各组裸鼠移植瘤组织，经western-blot检测，与对照组相比，阳性组MMP-9蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)，P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平无显著性差异(P＞0.05)；与对照组相比，沙蟾毒精低、高剂量组MMP-9蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)。取鹤蟾片在体实验各组裸鼠移植瘤组织，经western-blot检测，与对照组相比，阳性组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平无显著差异(P＞0.05)；与对照组相比，鹤蟾片组GPNMB蛋白、MMP-2蛋白、P-c-raf蛋白、P-erk1/2蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05)，且随着给药浓度的增加，下调作用增强。
9.99例非小细胞肺癌患者中，男性67例，女性32例；患者年龄最大84岁，最小32岁，平均年龄56.11±9.85岁；99例患者中有吸烟史的60例；发病部位，左肺26例，右肺73例；病例类型肺腺癌52例，肺鳞癌47例；发生转移的47例(部位包括肝、肺、骨、脑、肾上腺、淋巴结等)，未发生转移的52例。结果显示，与非转移组相比，转移组GPNMB蛋白表达量有显著性增加(t=3.596，P=0.001＜0.05)；经western-blot检测正常人肺上皮细胞及不同类型肺癌细胞中GPNMB蛋白表达情况，与正常人肺上皮Beas-2B细胞对比，A549组、H1299组、PC-9组GPNMB蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)。
结论：
1.鹤蟾片可以抑制肺癌A549移植瘤的体积及瘤重，且对小鼠肝肾功能无明显影响；沙蟾毒精可以抑制肺癌A549移植瘤的体积及瘤重，促进移植瘤组织细胞凋亡。
2.沙蟾毒精以浓度和时间依赖性抑制A549细胞、H1299细胞的增殖；以浓度和时间依赖性抑制A549、H1299细胞的迁移和侵袭。
3.沙蟾毒精以浓度依赖性下调GPNMB、MMP-2蛋白表达，以浓度依赖性下调信号通路蛋白P-c-raf、P-erk1/2蛋白表达，沙蟾毒精能逆转过表达GPNMB后引起的P-c-raf、P-erk1/2、MMP-2等蛋白的上调，因此考虑GPNMB为P-c-raf、P-erk1/2、MMP-2等蛋白的上游蛋白。同样，沙蟾毒精能逆转激活P-c-raf、P-erk1/2引起的MMP-2的上调，表明沙蟾毒精是通过GPNMB/Raf/Erk信号通路发挥抑制非小细胞肺癌的侵袭和转移的作用。
4.鹤蟾片通过GPNMB/Raf/Erk信号通路来发挥抑制肺癌侵袭和转移的作用。
5.GPNMB蛋白是非小细胞肺癌转移病人的干预靶点，值得进一步研究和推广。