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糜烂性毒剂(vesicants或blistering agents)是迄今仍具极大军事威胁的经典化学战剂之一。烷化剂氮芥(nitrogen mustard,NM)是糜烂性毒剂的典型代表,可引起难愈性皮肤损伤,尚缺乏有效治疗措施。研究表明,NM引起皮肤损伤的机制多样且复杂。目前认为,炎症反应在NM引起的皮肤损伤中起关键作用,贯穿NM诱导皮损发生、发展的全过程。然而,NM引起的皮肤炎症损伤的确切机制,至今仍未阐明,也是限制特效抗毒剂研发的关键所在。因此,明确NM诱导皮肤炎症损伤的确切机制,对于研制、开发特效抗毒药物有重要的军用价值,拓展对烷化剂类引起的炎症反应的认识。NLRP3(NLR pyrin domain containing 3)炎性小体是一种细胞内蛋白复合物,可被多种病原、大分子和环境刺激物激活。激活的NLRP3炎性小体可使Caspase-1活化,剪切IL-1β和IL-18而使其成熟,在维持固有免疫系统功能尤其是炎症反应中发挥重要作用;但是,过度激活NLRP3炎性小体可引发严重的炎症反应,进而造成机体损伤。近年来研究发现,NLRP3炎性小体介导的炎性损伤在理化刺激如紫外光、二硝基氟苯等引起的皮肤损伤的发生发展中起关键作用,抑制NLRP3炎性小体介导的炎性损伤可能成为防治该类损伤的新靶点。维生素D3(Vitamin D3,VD3)是一种脂溶性类固醇类激素,其主要由皮肤合成,具有显著的抗炎、抗氧化和代谢调节作用。最新研究证实,VD3能抑制NM诱导的小鼠皮肤炎性因子的释放,促进皮肤损伤愈合;同时还发现,VD3对NLRP3炎性小体有重要的调控作用。然而,关于NLRP3炎性小体在VD3改善NM诱导的皮肤炎性损伤中的作用及机制,目前尚未见相关报道。此外,前期研究证实,线粒体活性氧自由基(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)是NLRP3的重要激活因子之一;而线粒体去乙酰化酶SIRT3(Sirtuin 3)可通过直接结合并去乙酰化超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2,SOD2),增加SOD2活性维持mtROS的稳态,进而在调控NLRP3炎性小体活化中起关键作用。因此,基于现有的科学实验证据,我们提出如下假说:VD3可能通过调控“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路,抑制NLRP3炎性小体活化,进而改善NM诱导的皮肤炎性损伤”。为了验证该假说,本研究通过建立NM染毒皮肤损伤体内外模型,利用多种抑制剂、siRNA、激光共聚焦、Western blot等实验技术,首先检测了NLRP3炎性小体在NM诱导皮肤炎性损伤中的作用;同时,研究了“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路在其中的可能作用;并进一步探讨了该信号通路在VD3改善NM诱导皮肤炎性损伤中的作用,深入阐述了VD3改善NM诱导皮肤损伤的分子作用机制。本实验的主要实验结果如下:(1)NM诱导角质形成细胞炎性损伤。主要表现为:当NM浓度≤20μM时,对细胞增殖活力和形态无明显影响,却能浓度依赖性激活细胞促炎因子IL-1β的表达和分泌,上调COX2的表达水平。(2)NLRP3炎性小体在NM诱导角质形成细胞炎性损伤中发挥关键作用。NM能够浓度依赖性激活NLRP3炎性小体;抑制NLRP3炎性小体后,NM诱导的炎性损伤效应被显著削弱。(3)“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路在NM诱导角质形成细胞NLRP3炎性小体活化中具有重要作用。NM通过抑制SIRT3-SOD2通路促进细胞mtROS的生成,进而激活NLRP3炎性小体和炎性因子的生成;清除细胞内的mtROS能够显著抑制NM对NLRP3炎性小体的活化作用,改善细胞炎性损伤。(4)NLRP3炎性小体在VD3改善NM角质形成细胞炎性损伤中发挥重要作用。VD3能够显著抑制NM诱导的NLRP3炎性小体的生成,减少炎性因子表达和释放。(5)VD3通过激活SIRT3相关信号通路抑制NM诱导的NLRP3炎性小体活化。体外实验发现,VD3能部分逆转NM对SIRT3-SOD2抗氧化通路的抑制效应,同时减少mtROS生成,进而抑制NLRP3炎性小体活化及其介导的炎性因子生成,改善NM诱导角质形成细胞炎性损伤。利用SIRT3抑制剂和si RNA处理后,可明显抑制VD3对NM诱导的NLRP3炎性小体活化的抑制作用。同时,体内实验也证实,VD3干预能恢复NM染毒皮肤中SIRT3和SOD2的表达和活性,抑制皮肤组织炎性因子的生成,加速皮肤损伤修复。提示,SIRT3/NLRP3信号通路在VD3抑制NM诱导的皮肤炎性损伤中发挥重要作用。综上所述,本研究首次证实,糜烂性毒剂NM可以通过抑制“SIRT3-SOD2-mtROS”信号通路,使NLRP3炎性小体过度活化,引起角质形成细胞的炎性损伤;VD3可通过该信号通路抑制NLRP3炎性小体活化,从而改善NM诱导的角质形成细胞和皮肤的炎性损伤。研究结果对于进一步揭示NM诱导皮肤损伤及VD3改善NM诱导皮肤损伤的具体作用机制提供了新的视角;同时对于探索NM中毒防治新策略具有潜在的应用价值。