卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)不仅在生殖系统中发挥重要作用,最近研究发现其在多种肿瘤血管内皮细胞特异性表达,与肿瘤血管新生有密切关系,并且可能参与骨质疏松症的发生。所以FSHR在肿瘤和女性绝经后骨流失的诊断以及治疗方面是一个潜在的靶点。骆驼纳米抗体是天然缺少轻链的重链抗体的可变区片段,具有分子小(15 k D),免疫原性弱,稳定性强等优点,在疾病的诊断和治疗中具有广阔应用前景。目前主要通过噬菌体展示技术获得纳米抗体,但该技术存在文库多样性有限、筛选结果不确定和不容易得到高亲和力抗体等缺点。高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology,NGS),能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。采用NGS技术可以比较免疫前后的抗体库序列的富集情况,有可能发现和获得抗原特异的抗体。本研究的主要目的在于利用高通量测序技术制备抗FSHR骆驼纳米抗体并验证其特异性以及亲和力,探讨NGS在抗体的发现和鉴定过程中的价值。本研究内容主要包括以下两方面:1、FSHR免疫后骆驼淋巴细胞重链可变区基因库的DNA高通量测序及分析:首先,利用IPTG诱导BL21-pET30a-fshr234原核表达FSHR抗原蛋白,利用镍柱纯化得到的重组蛋白FSHR对新疆双峰驼进行皮下免疫。分离免疫前以及免疫第五次、第六次后的骆驼血清并利用间接ELISA测定血清中抗FSHR抗体滴度;大量采集骆驼全血并分离骆驼外周血淋巴细胞提取总RNA,以反转录c DNA为模板,利用巢式PCR扩增VHH片段并进行高通量测序。最后通过生物信息学软件对二代测序数据进行深度分析得到目的抗体VHH序列。间接ELISA表明在抗原FSHR蛋白免疫六次后,新疆双峰驼血清中抗FSHR抗体滴度到达1:128000,说明抗原FSHR在骆驼体内激起了较高的体液免疫反应,为后期高通量测序的质量提供保证。提取骆驼外周血淋巴细胞的总RNA并反转录得到c DNA,以c DNA为巢式PCR扩增的模板获得目的VHH片段。NGS测序后共获得2,344,304条序列,去除接头拼接后得到1,172,152条VHH序列,低质量序列处理后,最终符合要求的可用的抗体序列有839,219条,质量分数>30%的序列占所有序列的80%。测序后得到的核苷酸长度主要分布在300-350nt附近,且核苷酸长度以325 nt为中心呈泊松分布;通过对CDR3序列的频数统计以及CDR3长度的统计,选择了CDR3频数最高的10个序列作为目的抗体序列并将这些序列构建到pET28b载体上用于纳米抗体的原核表达。2、抗FSHR骆驼纳米抗体的制备以及性质鉴定首先将NGS分析得到的10个VHH序列克隆到原核表达载体pET28b上进行原核蛋白表达,命名为BL21-pET28b-S1-10,利用终浓度为0.2 mM IPTG诱导表达S1-S10蛋白,采用镍离子亲和层析方法纯化诱导表达的S1-S10蛋白。其次利用间接ELISA和Western-Blot检测诱导纯化得到的抗体S1-S10对抗原FSHR的特异性以及结合能力,从而挑选出对抗原结合力较高的特异性抗FSHR抗体。除此之外,利用细胞免疫化学方法检测抗体S6和S9与表达FSHR抗原的真核细胞Caov-3的结合能力。实验结果表明,重组质粒pET28b-S1-10经0.2 mM IPTG、30℃诱导,其中抗体S2、S3、S8、S9、S10有部分上清表达,抗体S5、S6、S7全部为包涵体表达,抗体S1和S4蛋白未成功表达,所有蛋白大小均在19 k D左右。间接ELISA和Western Blot表明,与阴性对照相比较,S6和S9抗体对抗原FSHR有极显著的特异性(p<0.01)及一定的结合能力。细胞免疫化学检测S6和S9与FSHR阳性表达的人卵巢癌细胞Caov-3无明显结合。本研究表明,原核表达抗原FSHR在新疆双峰驼体内可以激发较高的体液免疫反应。利用高通量测序技术与生物信息学分析相结合,成功获得并制备得到具有一定结合力的抗FSHR骆驼纳米抗体,说明利用高通量测序技术有可能发现新的纳米抗体。但欲获得高亲和力的抗体还需要结合免疫前的抗体序列丰度分析,以及对实验条件进行优化和对数据进行深入挖掘。