一、研究背景骨髓间充质干细胞,成骨细胞和破骨细胞的分化、增殖及迁移是骨骼生长发育,骨损伤后修复等各种骨基本生理过程中重要的组成部分。骨的功能包括给软组织提供机械支持,保护大脑脊髓,支持造血等,以上骨功能的发挥依赖于骨组织的持续更新,分别由成骨细胞和破骨细胞进行骨质生成和吸收。当骨生成障碍或吸收过度时便可带来一系列相关疾病的发生,如成骨不全,骨不连,类风湿性关节炎,骨质疏松等疾病。成骨不全是严重影响儿童骨骼发育的遗传性疾病,而类风湿性关节炎、骨不连和骨质疏松是骨科中常见但治疗时间漫长,花费较大且治疗效果不理想的疾病。随着技术的进步,除了传统的治疗方法,细胞治疗,基因治疗为治疗骨科疾病也提供了新的可能。以往在治疗骨质缺乏的疾病中多采用抑制骨吸收的方式,而促进骨质合成将会成为治疗这类疾病的重要部分。了解骨系统中各细胞的功能及分子调控机制将会为治疗这些疾病提供更有效的途径。骨发育及损伤后重建受到细胞内外多种信号的调控,既包括发挥全身作用的激素调控,也有细胞外因子的局部调控。目前研究较多的调控因子有骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞样生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子(IGF)。其中,多篇报道表明BMP在治疗骨缺损,骨不连及股骨头坏死中取得了良好的疗效。胰岛素样生长因子-1在长骨的发育中发挥着重要的调控作用,可通过抑制程序性凋亡增加骨髓间充质干细胞生存及诱导干细胞向软骨细胞分化,促进细胞外软骨基质的表达。成纤维细胞样生长因子是体内最有效的血管生存因子,同时对成骨细胞,成软骨细胞的增殖及分化有明显促进作用。高迁移率族蛋白(high mobility group protein HMG)作为广泛存在于真核生物细胞内的一类非组蛋白染色体结合蛋白,在细胞内通过与多种转录因子、复制蛋白及甾体受体作用,参与DNA重组、修复、基因转录调控,细胞复制和分化成熟等多种生理病理过程。但是它可以通过免疫细胞主动分泌到细胞外,也可由坏死细胞被动释放到细胞外。在坏死细胞中,高迁移率族蛋白B1(HMGB1)从染色体上解离,随着细胞膜及核膜的解体释放到细胞外。而在活化的单核细胞,巨噬细胞及树状突细胞中,HMGB1可发生甲基化,转移到细胞浆中,然后主动分泌到细胞外。当其释放到细胞外时,便广泛参与了多系统疾病的发生发展。最先关于HMGB1细胞外作用是由学者Wang及同事报道,在该文献中发现巨噬细胞在内毒素刺激8小时后可分泌HMGB1,应用HMGB1的抗体可减少脓毒血症的死亡率,而应用HMGB1可导致大鼠的死亡。随后有大量报道表明重组高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)可以促进成肌纤维细胞,成肌血管细胞的增殖和迁移,是一种多功能细胞因子,参与了包括炎症,骨骼肌心肌缺血再灌注损伤的修复,肝脏纤维化和肿瘤发生及转移的病理过程。目前有许多研究均表明高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)也是一种骨活性细胞因子,广泛参与着骨的多种生理病理过程。有研究表明在生长板的肥大软骨层内细胞浆中可发现大量的HMGB1的聚集,通过组织培养证实软骨细胞可分泌HMGB1,并且是在软骨细胞分化的早期进行。HMGB1基因敲除后发现大鼠长骨的生长板明显增宽,成骨细胞和破骨细胞以及血管内皮细胞侵入能力下降,长骨的生长发育受到明显限制,导致骨量下降,骨形态弯曲易于骨折。而且有文献报道HMGB1可促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化并诱导其迁移,但抑制干细胞的增殖。HMGB1联合脂质体(LPS)可促进骨性关节炎的滑膜成纤维细胞向类风湿性关节炎的滑膜成纤维细胞表型转化,并诱导细胞的凋亡及自噬的增加,增加骨关节软骨的破坏。在骨骼系统中,骨髓间充质干细胞(BMSC)在受到HMGB1刺激后增加了核因子kB受体活化因子配体/骨保护素(RANKL/OPG)的表达,释放了大量的白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-a (TNF-a)。MLO-Y4骨细胞样细胞,MC3T3-E1成骨细胞样细胞以及原代鼠骨髓来源的成骨细胞在受到肿瘤坏死因子-a及环乙酰亚胺(CHX)刺激时发生凋亡,并且可释放HMGB1。HMGB1的受体主要包括toll样受体2/4 (TLR2/TLR4)及晚期糖基化终末产物受体(RAGE)。RAGE基因敲除鼠表现出明显骨异常,包括骨量增加,骨生物强度增强,破骨细胞数量减少。RAGE基因敲除鼠在卵巢切除后与野生型对比,骨量无明显减少,破骨细胞的活性下降,骨吸收能力减弱。而Toll样受体是一类广泛表达于细胞表面的受体家族,不仅参与机体对外源性微生物的免疫反应及肿瘤免疫,而且可促进骨骼肌缺血坏死后的修复,目前有报道其在激素型股骨头坏死及多种骨病中发挥着重要的作用。成骨细胞表面同样可表达TLR2及TLR4,有报道发现LPS可通过TLR诱导小鼠成骨细胞表达NF-κB受体活化因子配体(RANKL)。用类脂A诱导TLR4基因突变的C3H/HeJ小鼠原代成骨细胞,RANKL mRNA合成没有增加,提示TLR4在该过程中起关键作用。综上所述,HMGB1在骨系统中发挥着重要的作用,成骨细胞以及成骨细胞样细胞可表达并释放HMGB1并且均可表达所有HMGB1已知的受体,但其对成骨细胞迁移及增殖过程中的作用及相关分子机制仍较缺乏,基于以上的报道,特设计本实验研究HMGB1对大鼠成骨细胞迁移及增殖能力的影响,然后利用小干扰RNA干扰技术抑制成骨细胞表面TLR2及TLR4的表达,观察在HMGB1刺激下成骨细胞迁移及增殖能力的改变,并检测细胞内核因子KB(NF-κB)含量的变化,探索HMGB1对成骨细胞的影响及其可能的分子机制,为更好的治疗骨合成障碍或骨质疏松等相关疾病打下坚实的基础。二、研究目的1.研究HMGB1对大鼠成骨细胞增殖及迁移的影响：重组HMGB1对体外培养的大鼠成骨细胞增殖以及迁移能力的影响及规律。2.研究HMGB1影响成骨细胞迁移的分子机制：通过利用小干扰RNA干扰技术研究toll样受体2(TLR2)及toll样受体4(TLR4)在成骨细胞迁移过程中的作用及对相关转录因子核因子-κB (NF-κB)的活化影响,确定其作用途径和分子机制。三、研究方法1.材料和试剂：SD大鼠成骨细胞购自中国天津威凯生物公司；胎牛血清,胰酶及DMEM培养液；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO); Trizol及Turbofect转染试剂；逆转录试剂盒及PCR试剂盒；NE-PER胞核胞浆提取试剂盒；rhHMGB 1; TLR 2, TLR 4, NF-κB p65及GAPDH的抗体。2.细胞培养：将成骨细胞以每孔2×105个接种于六孔板,用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37℃,5% CO2的孵箱中,每两天更换一次培养液,将细胞分为空白对照组,TLR2-siRNA转染组和TLR4-siRNA转染组。3.TLR2及TLR4 siRNAs的设计及转染：设计合成三对针对TLR 2, TLR 4的siRNA,以与人类基因无同源性的siRNA作为阴性对照(siRNA序列见正文)；将成骨细胞培养至70-80%融合时,吸去旧的培养基,用PBS轻洗2次,每孔加入1.6mL无血清培养基,置于5% CO2、37℃培养箱中；取浓度为20gM的siRNA/microRNA 2μl,加入400μL无血清培养基中,混匀后,加入4μl Turbofect siRNA转染试剂,混匀后在室温下孵育15-20min;每孔加入上述孵育好的转染复合液400μl,置于5% CO2、37℃培养箱中培养4-6h后换成正常的完全培养基,转染后24-48h,检测mRNA及蛋白表达水平。4. RT-PCR:siRNA转染24h后收集细胞,按照Trizol说明书进行细胞总RNA提取,反转录合成cDNA。后以cDNA为模板,进行PCR扩增(引物序列见正文)。反应条件为95℃ 10min;然后95℃15s,60℃ 30s,72℃15s,95℃ 15s,共40个循环；然后60℃ 1min,95℃15s。绘制熔解曲线及标准曲线,以GAPDH为内参,通过△ACT方法分析基因的表达结果。至少重复进行三次单独的实验。5. Western印迹法及蛋白细胞浆细胞核抽提技术：siRNA转染24h后收集细胞,提取细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白定量；采用细胞核及细胞浆提取试剂盒提取NF-κB p65胞核和胞浆蛋白,Lam in B1和GAPDH分别作为胞核和胞浆内参,采用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白40μg上样,进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE),浓缩胶80V,分离胶120V恒压电泳,350mA恒流转膜1h。然后用5%脱脂奶粉的TBST液中封闭2h,加入抗TLR2, TLR4及GAPDH抗体4℃孵育过夜,次日室温孵育1h后TBST洗膜10min3次,用辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗兔IgG孵育1h,TBST洗膜10 min 3次,增强型化学发光试剂(ECL)显色,X胶片曝光,采集图像。采用Uvipro凝胶成像系统扫描胶片,IPP6.0软件分析光密度值,以目的蛋白和相应内参条带的光密度比值表示目的蛋白的表达水平。6.细胞增殖测定：采用MTT法检测细胞增殖情况,取不同组成骨细胞按5×103个/mL接种至96孔板,每孔200μl,设置3个复孔,置于37℃,5%C02培养箱中培养1-3d,在培养结束前4h每孔加入20μl MTT溶液,然后培养结束后弃去培养液,每孔加入150μl DMSO,震荡10min,酶标仪检测492 nm处的吸光值。7.细胞迁移测定：采用Boyden Transwell小室法(24孔微孔聚碳酸酯膜,孔直径8.0 μm,膜厚度6.5 mm)进行细胞迁移检测.将细胞密度调整为1×105个/mL经不同处理后的成骨细胞100μl加入上室中,下室加入500μl含15%FBS的DMEM培养液,置于37℃,5%CO2培养箱中培养4h后,弃去培养液,用棉签擦去上室内未迁移的细胞,95%酒精常温固定30min,结晶紫染色20min,PBS清洗,在显微镜10倍视野下观察,每一样本随机选取4-5个视野,计数每个视野下染色细胞数量,取其平均值。四、统计分析应用SPSS 18.0进行统计分析,数值变量资料以均数±标准差(M±SD)表示,每组实验重复三次,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。五、研究结果1.HMGB1促进成骨细胞迁移,同时不影响成骨细胞增殖我们利用Boyden Transwell小室法检测细胞的迁移能力,利用MTT法检测细胞的增殖能力。将细胞培养液中分别加入浓度为0,50,100,150,2001μg/L的重组人HMGB1,进行培养24h后,将各组细胞加入Transwell小室的上层中,进行迁移实验。结果发现迁移4h后,大量的成骨细胞转移到下层,通过计数发现HMGB1可促进成骨细胞迁移,并呈浓度依赖性,在浓度为150μg/1时细胞迁移能力最强,为对照组的2倍(p<0.05)。选择该浓度进行下一步实验。MTT法显示不同浓度HMGB1刺激下细胞的增殖能力无明显改变。2.siRNA转染可有效抑制成骨细胞TLR2,TLR4的mRNA及蛋白表达水平通过RT-PCR及Western印记法检测转染24h后成骨细胞TLR2, TLR4的mRNA及蛋白表达水平。结果表明3组针对TLR2及TLR4的siRNA都能有效沉默相应受体mRNA及蛋白的表达(p<0.05);其中TLR2-siRNA392, TLR4-siRNA703组与空白对照组相比,TLR2及TLR4的mRNA表达水平分别下调了94%和84%,蛋白表达水平分别下调了52%和35%(p<0.05)。因此后续实验选用TLR2-siRNA392, TLR4-siRNA703进行基因转染。3. HMGB1通过TLR2或TLR4诱导成骨细胞NF-κB的活化选择沉默效率最高的TLR2-siRNA392, TLR4-siRNA703进行转染后,将细胞分为3组,分别为对照组,TLR2-siRNA组,TLR4-siRNA组,通过胞浆胞核提取技术及Western印迹法检测各组细胞在受到重组人HMGB1刺激前后细胞核内外NF-κB p65的含量。当对照组成骨细胞受到HMGB1刺激后,细胞核内NF-κB p65明显升高,但利用TLR2-siRNA及TLR4-siRNA转染细胞后,细胞TLR2及TLR4表达下降后,在同样重组HMGB1刺激下,细胞核内NF-κB p65增加的含量较未转染组降低,降至对照组的47%和75%(p<0.05)。4.HMGB1通过TLR2或TLR4诱导成骨细胞的迁移选择沉默效率最高的TLR2-siRNA392, TLR4-siRNA703转染后,将细胞分为3组,分别为对照组,TLR2-siRNA组,TLR4-siRNA组,检测各组细胞在受到重组人HMGB1刺激前后改变的迁移数量。实验发现对照组成骨细胞受到重组人HMGB1 (150μg/l)刺激后,细胞迁移能力增加了2倍(P<0.05),但TLR2-siRNA组及TLR4-siRNA组在相同浓度的HMGB1刺激下,增加的细胞迁移数量较对照组明显降低(P<0.01)。说明TLR2/TLR4参与了HMGB1诱导的成骨细胞迁移。六、结论在本研究中,我们发现重组人HMGB1可促进大鼠成骨细胞迁移,大鼠成骨细胞在受到重组人HMGB1刺激后,通过Transwell实验发现细胞迁移能力较对照组增加了2.3倍,MTT实验显示细胞的增殖能力未受到明显影响。成骨细胞可表达TLR2及TLR4,利用siRNA干扰技术,有效抑制了TLR2和TLR4mRNA的表达,抑制率分别达到了94%和84%,同时蛋白表达水平也受到了显著的抑制,说明本实验筛选TLR2, TLR4的siRNA具有高效性,高特异性,是一种选择性沉默基因表达的有效工具。当TLR2及TLR4受到siRNA制后,在相同浓度的HMGB1刺激下,细胞迁移能力的增加受到了明显的抑制,同时NF-κB细胞核内活化能力下降,但是细胞增殖的变化未受到明显影响。以上表明HMGB1可通过TLR2, TLR4及NF-κB促进成骨细胞迁移,并不影响细胞的增殖能力。联合文献报道HMGB1可刺激骨髓问充质干细胞的迁移,并可联合其他炎性因子促进破骨细胞的形成,可推测HMGB1在骨系统中可通过协调成骨系统和破骨系统的作用来完成骨损伤后的修复和软骨内成骨过程,本研究对HMGB1对成骨细胞的具体作用及相关可能机制提供了重要补充,首次显示激活的NF-κB参与了成骨细胞的迁移。并且toll样受体作为机体自然免疫系统的重要成分,在成骨细胞表达并参与迁移过程,也进一步将成骨细胞与免疫系统联系起来。目前在骨质疏松等疾病的治疗中,更多是通过抑制破骨细胞分化和活性来抑制骨质吸收,但如何弥补由于骨吸收或破坏带来的骨量丢失还未得到有效解决,因此研究成骨细胞增殖及迁移可能为将来在抑制骨吸收同时如何促进骨形成打下有利的基础,为多种骨病中骨量流失的治疗发挥新的思路。