一、研究背景及现状: 关节软骨全层损伤往往并发软骨下骨硬化或囊性变等损伤，骨坏死后期因关节面塌陷可致关节软骨结构破坏，因此长骨干骺端病损无论原发于关节软骨或骨，到后期均表现为骨软骨同时破坏，目前对这种软骨合并软骨下骨损伤的治疗困难，效果欠佳<[1,2,3]>。尤其关节软骨再生能力极其有限，一旦损伤，病损关节往往不可遏止地逐步恶化，最终导致骨关节炎(o s t e o a r t h r i t i s，O A)。仅修复软骨而不处理病变的软骨下骨也难以得到满意的效果。各种原因所致的关节坏死、关节缺损、关节强直、关节挛缩等是导致患者导致关节功能障碍，伤残，引起关节永久性的结构和功能损失的重要原因，这种情况在负重的髋、膝等大关节尤其常见。 随着材料学、细胞生物学、工程学以及相关物理、化学学科的发展，一种新的组织缺损的修复方法——组织工程(tissue engineering)逐渐被提出并应用。组织工程是一门应用工程学和生命科学的原理和方法，来研究正常或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长机制，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代物的新兴综合性交叉学科。其最基本的思路是采集功能相关的活细胞，种植于天然或人工合成的、具有一定空间结构的三维支架上，在体外培养，使细胞大量增殖，然后将其移植人体内，达到形成具有一定结构和功能的组织和器官的目的。细胞培养支架的选择是组织工程学研究的焦点之一。支架材料作为人工细胞外基质，为功能细胞的停泊、生长、繁殖、新陈代谢提供三维空间。随着材料的降解吸收，细胞所分泌的基质长人，逐渐形成新的组织，在这一发育过程中，逐渐替代病变的组织或改善其功能<[4]>。其三大要素是：种子细胞、支架材料及工程组织和器官的发生，其中支架材料具有不可替代的主要作用，且与材料科学的发展有着密不可分的关系。组织工程的出现为解决组织缺损的问题提供了新思路．使组织缺损的完全再生成为可能<[4]>。 人体的器官由多种不同的组织成分构成，关节头由骨及其表面的透明软骨构成，具有特殊的解剖结构和生理特点，用人工材料难以完全替代，再造生物性关节头正是组织工程技术最有前景的领域之一。目前组织工程技术用来再造细胞成分单一的组织，如软骨、骨等，己获得广泛的成功<[5,6]>。但对于由多种细胞成分构成的复杂组织的再造，研究报道还较少。 单纯组织工程软骨修复关节骨软骨复合缺损时，移植体与移植床的愈合的界面是软骨～软骨界面的整合；若合并软骨下骨缺损，则尚有软骨～骨界面的整合。其修复过程中上述两种界面的整合较慢，移植体在移植床存在植入早期的不稳定等潜在的不稳定因素，可能导致修复失败因素。骨组织之间的整合比骨和软骨间整合快而且更加牢固．本实验构建组织工程骨与软骨复合物，旨在修复软骨下骨缺损同时，使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨～骨变为骨～骨界面，从而加快界面的愈合<[7,8]>。 采用带骨软骨移植修复负重面软骨缺损具有以下优点：(1)软骨下的骨栓与受体部位的骨床可以紧密嵌合，获得初期的稳定性，这为以后的生物学愈合修复过程奠定了基础；(2)软骨下骨是松质骨，它与受体骨槽的结合部位有丰富的血供，从而为移植体的存活创造了条件；(3)软骨下骨与受体骨槽完成骨的一期愈合过程，没有多少骨痂形成，松质骨骨小梁逐渐连通，成骨细胞爬入，骨缝消失，为移植软骨的负重功能提供良好的基础；(4)透明软骨之间的间隙可以通过软骨细胞爬入，纤维细胞的化生等过程进行修复，从而弥合间隙，完成最终的修复过程，获得一个局部光滑平整、可以承重的透明软骨面<[9,10]>。 采用组织工程学方法构建骨软骨复合组织的时间并不长，近5年来逐步从外培养发展到体内植入，研究过程中发现了一些新问题。例如，李旭升<[11]>等将骨髓基质细胞(B M S C s)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(P L G A)构建组织工程软骨，经成骨诱导的B M S C s接种于聚乳酸/聚羟乙酸共聚物/磷酸三钙(P L G A/T C P)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明，组织工程软骨在体内可形成软骨组织，组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。Gao<[12]>等将大鼠干细胞诱导成软骨细胞后接种于透明质酸海绵，诱导成成骨细胞后接种于多孔磷酸钙陶瓷，然后用纤维蛋白陶瓷将两者粘结在一起，于裸鼠皮下进行培养，结果显示构建出了骨软骨复合组织。 但是以上方法均存在构建组织的骨软骨界面结合不佳的问题。而关节骨和软骨的界面结合强度不足将难以满足关节载荷的要求。目前骨软骨复合组织构建研究在促进软骨与软骨下骨界面形成方面还有待于进一步完善。有文章报道<[13]>，骨软骨界面结合不佳是由于不同支架材料本身的物理特性(如支架的热膨胀系数，弹性性能等)。Chang<[14]>等将组织工程软骨凝胶支架交联于三维的多孔磷酸钙表面，然后接种软骨细胞于凝胶支架，将复合物进行体外培养，4周后结果显示构建的组织工程软骨长入了多孔支架的内部，二者的界面结合良好，这一实验证明了组织工程凝胶材料可以渗透入三维多孔支架的内部。但是Chang的实验只是在空白成骨支架上构建出组织工程软骨组织，并不是真正意义上的组织工程骨软骨复合组织。本实验就是希望在构建出组织工程骨软骨复合组织的同时，较好地解决组织工程骨软骨界面结合欠佳的问题。 二、研究目的: 1．探讨PIuronic-F127和PLGA作为组织工程支架联合应用于构建组织工程骨软骨组织的可行性。 2．解决组织工程骨软骨界面结合欠佳的问题。 三、研究方法: 1．兔关节软骨细胞及成骨细胞的培养：分别取兔关节软骨及胫骨骨膜，用酶消化法原代培养得到软骨细胞及成骨细胞，并分别对培养的软骨细胞及成骨细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶染色鉴定。继而大量扩增细胞。 2．组织工程骨软骨的构建及裸鼠体内培养： ①支架的预处理：将PLGA支架材料加工成厚10mm×6mm×4mm大小，用无水乙醇及三蒸水充分浸泡清洗使支架湿化。使用前泡入培养液中过夜预湿，并以多聚赖氨酸包被，增强细胞对支架的贴附力，将PLGA支架随机分为两组，分别作为实验组和对照组1，每组各5枚。 ②组织工程骨的体外构建：取生长状态良好的第4代成骨细胞，用培养液配制成密度为5×10<7>/m l的细胞悬液，缓慢滴加到干燥后的实验组PLGA表面，置于37℃，体积分数为5﹪CO<,2>孵箱，静止培养4h后再加入条件培养基于细胞培养箱中共同培养2d，使细胞在材料表面完全贴附。 ③组织工程软骨的体外构建：以PBS配制30﹪浓度的Pluronic-F127，在4℃液态状态下将生长状态良好的第3代软骨细胞与其混匀，制成细胞凝胶复合物，使软骨细胞终浓度为5×10<7>/mL。 ④组织工程骨软骨的体外构建及体内培养：2d后取出培养的实验组成骨细胞-PLGA，在其表面涂布薄层的负载软骨细胞的Pluronic-F127水凝胶，厚约1mm。单纯空白PLGA支架和单纯空白Pluronic-F127凝胶分别作为对照组1和对照组2。体重为20g左右裸鼠，共5只，麻醉后无菌条件下于背部正中做长约1.5cm切口，钝性分离皮下层，各组材料植入裸鼠背部皮下组织中，每只裸鼠均植入3块材料，切口两侧分别作为实验组侧和对照组侧，切口左侧植入组织工程骨软骨复合物，切口右侧植入对照组1和对照组2。术后用丝线缝合切口，75﹪酒精消毒切口。标记后将动物放入无菌饲养包内分笼饲养。 3．取材并观察标本：于2个月后处死动物取材，大体标本观察，并常规脱钙，脱水，石蜡包埋后切片，行HE染色．光镜下观察骨组织及软骨组织形成情况，Ⅱ型胶原免疫组化观察软骨细胞Ⅱ型胶原表达能力。 四、结果: 1．大体观察：术后2个月实验组成功构建出组织工程骨软骨组织，在PLGA的上半部分形成的组织为白色，表面较光滑，有弹性，为软骨组织；下半部分为暗红色，质地较坚硬，为骨组织，再造出的两种组织间有清晰的界限。骨组织与软骨组织结合牢固。 2．组织学观察：①组织工程骨观察：PLGA支架中可见有可观察到明显的成骨现象，新形成的骨组织连接成片块状或条索状。②组织工程软骨观察：软骨组织中细胞多，形态基本正常，分布较均匀。软骨细胞增殖成株状或岛状，可见同源软骨细胞簇，多位于软骨陷窝内，基质较丰富。③二者结合界面观察：二者结合界面结合良好，在部分界面区域可见软骨组织与骨组织相互长入。 3．软骨组织Ⅱ型胶原免疫组化结果阳性，表明构建软骨分泌Ⅱ型胶原为主。 五、结论: Pluronic-F127和PLGA分别作为软骨细胞和成骨细胞的组织工程支架，采用向成骨细胞-支架复合物涂抹软骨细胞凝胶的方法，可以构建组织工程骨软骨复合物，并较好的解决了骨软骨界面结合欠佳的问题。